Ақпарат

Колориметр көмегімен балдырларды анықтау үшін қандай толқын ұзындығын қолдану керек?


Мен балдырлардың тығыздығын өлшеуді қамтитын биология жобасын жасап жатырмын (Наннохлоропсис) абсорбциялық колориметрияны қолдану. Колориметрді қандай толқын ұзындығына орнатуым керек?

Мәселе мынада, хлорофиллдің екі түрі бар, олардың әрқайсысының оңтайлы жұтылуы әртүрлі, спектрлік шашырауды, сондай-ақ төменгі толқын ұзындығына барған кезде УК жұтуын ескеру қажет. Не істеу?


бастап Биотек Мен мынаны білдім:

Балдырлар дақылдарының спектрлік сканерлеулері 400 нм-ден төмен маңызды жұтушылықты, сондай-ақ 440 нм және 675 нм-де екі түрлі сіңіру шыңдарын көрсетеді (1-сурет). Жасуша санын анықтау жасуша құрамдас бөліктерінің сіңіруінен гөрі жарықтың шашырауын пайдаланған кезде ең дәйекті болады. Материалды сіңіруге әсер етпеу үшін 600 нм өсуді бақылау үшін [ең жақсы].


Сурет 1. Microcystis aeruginosa суспензия дақылдарының абсорбциялық спектрлік қисығы. Дереккөз: Biotek


Концентрация және колориметрия

Сіздің студенттеріңіз шоғырлану тұжырымдамасымен күресіп жатыр ма? Олар М1В1 = М2В2 есте сақтаудан басқа нақты қолданбаға дейін? Түсті ерітінділермен тәжірибе жасап көріңіз! Түстің қарқындылығы студенттерге тұжырымдаманы елестетуге көмектесетін тамаша белгіні береді, ал PASPORT колориметрі студенттерге әрекетті сандық түрде анықтауға мүмкіндік береді.

Алдымен көк бояу ерітіндісін дайындап, оны «1,0 М» деп белгілеңіз. Студенттерге қор ерітіндісінен әртүрлі концентрацияларды дайындаңыз. өтініші М1В1 = М2В2 кестені толтыру және шешімдерді дайындау үшін қажет.

Дайындалатын концентрация (М) 1,0 М ерітіндінің көлемі (мл) Су көлемі (мл) Жаңа ерітіндінің жалпы көлемі (мл)
0.0 0 10 10
0.2 10
0.4 10
0.6 10
0.8 10
1.0 10 0 10

Осы сәттен бастап олар ерітінділердің концентрациясын визуалды түрде ажырата алады, сонымен қатар олар бұл әсерді Колориметр көмегімен сандық түрде анықтай алады.

Колориметр бір уақытта төрт толқын ұзындығында % өткізгіштік пен жұтылуды өлшей алатындықтан, оқушылар өздері көріп тұрған ерітіндінің түсі мен ерітінді әсер ететін жарық түсі арасындағы байланысты анықтай алады.

Кюветадағы тазартылған суы бар жасыл түймені басу арқылы колориметрді босатыңыз, содан кейін барлық төрт толқын ұзындығының % өткізгіштігі мен сіңіру деректерінің цифрлық дисплейлерін жасаңыз. Қолмен іріктеуге ауысыңыз және 1,0 М ерітіндіні Колориметрге салыңыз.

Көк түсті ерітінді негізінен көк жарықты өткізеді. Сондықтан ол біздің көзімізге көк болып көрінеді. Көк түсті ерітінді негізінен қызғылт сары түсті сіңіреді, өйткені қызғылт сары - қосымша түс. Қызғылт сары жарық ең көп әсер ететіндіктен, талдау 610 нм толқын ұзындығында жасалуы керек.

Енді студенттер зерттеу үшін ең жақсы толқын ұзындығын анықтаған соң, олар ерітіндінің әртүрлі концентрацияларын сандық бағалауға кірісе алады. Бірақ олар абсорбцияға немесе % өткізгіштікке қарау керектігін қайдан біледі? Олар екеуін де жасай алады және салыстыра алады!

Концентрация (x осі) және қызғылт сары % өткізгіштігі (y осі) бар кесте және график бар бетті жасаңыз. Енді сіз дайындаған ерітінділердің концентрациясын енгізіңіз. Олар енгізілгеннен кейін әрбір кюветаны Колориметрге салып, мәнді сақтаңыз.

Қызғылт сары %өткізу орнына қызғылт сары сіңіру арқылы процесті қайталаңыз. SPARKvue ® ішіндегі бірнеше у осі мүмкіндігін пайдалану арқылы екі өлшемді бір графикте салыстыруға болады.

Абсорбция деректері әлдеқайда түзу сызықты береді. Сіңіру мен концентрация арасындағы бұл байланыс Беер заңының негізі болып табылады. Студенттер абсорбция деректері негізінде белгісіз көк ерітінділердің концентрациясын анықтау үшін осы жаңадан құрастырылған қатынасты қолдана алады.

Көк бояу мен колориметрі бар бұл қарапайым әрекет студенттеріңізге ерітінділердегі айырмашылықтарды көру және PASPORT колориметрімен өлшеу арқылы концентрацияны визуализациялау және сандық анықтау мүмкіндігін берді. Сонымен бірге олар колориметрия/спектроскопияның кейбір іргелі тұжырымдамаларын құрастыруда, соның ішінде сәйкес толқын ұзындығын және Сыра заңын қалай таңдау керек.


Колориметр көмегімен балдырларды анықтау үшін қандай толқын ұзындығын қолдану керек? - Биология

А спектрофотометр — электромагниттік сәулеленудің таңдалған толқын ұзындығын ерітінді арқылы өткізетін және ерітіндінің сіңіретін (өтуге мүмкіндік бермейтін) немесе жіберетін (өтуге мүмкіндік беретін) электромагниттік сәулелену мөлшерін өлшейтін құрал. Сілтемеленген бетте көрсетілген электромагниттік спектрге бір сәт қараңыз, ( Өмір, биология ғылымы, Purves және т.б., 5-ші басылым, 1998). Спектрофотометрдің бір түрі ультракүлгін (УК) толқын ұзындығын пайдаланады, мысалы, күннің күйіп қалуын тудыратын толқын ұзындығы. Басқа түрі жылу ретінде ең таныс инфрақызыл (ИК) толқын ұзындығын пайдаланады. Олардың біреуін басқа курста пайдалану мүмкіндігіңіз болуы мүмкін. Біз осы курста қолданатын спектрофотометрдің үшінші түрі күлгіннен қызылға дейінгі жарықтың әртүрлі түстері деп ойлайтын көрінетін толқын ұзындығын пайдаланады. Бұл таныс түстер болғандықтан, спектрофотометрдің бұл түрі «колориметр» деп аталады. Біз қолданатын нақты модель - Spectronic 20 колориметрі.

Осы семестрде Spectronic 20 колориметрін үш түрлі зертханалық жұмыс түрлерінде қолданатындықтан, оның қалай жұмыс істейтінін және оны қалай дұрыс пайдалану керектігін түсінуіңіз керек. Колориметрия төменде сипатталғандай екі әдістің бірімен ерітінділердің құрамын талдау үшін колориметр қолданылатын процедура болып табылады. Мұны біз де атай аламыз көрінетін спектрофотометрия, өйткені біз көрінетін толқын ұзындығын қолданамыз. Ультракүлгін спектрофотометрия және ИҚ спектрофотометрия ультракүлгін немесе инфрақызыл толқын ұзындығын пайдаланады, әрине, олар әртүрлі құралдарды қажет етеді, өйткені Spectronic 20 тек көрінетін толқын ұзындығын шығаруға және анықтауға арналған.

Жұтылатын электромагниттік сәулелену құбылысы сізге көп жағынан таныс. Мысалы, теріге күн сәулесінің жеткілікті ұзақ әсер етуі «күнге күйік» тудырады. Бұл тері жасушаларындағы молекулалардың күн сәулесіндегі ультракүлгін сәулелерді сіңіруінің нәтижесі. Теріге жағылған күннен қорғайтын кремнің мақсаты - қамтамасыз ету басқа молекулалар ультракүлгін сәулені теріге жетпей тұрып сіңіру. Нүкте? Молекулалар электромагниттік сәулеленуді жұтады және бұл жұтылуды анықтауға болады . күнге күйіп қалу ауырады! Тағы бір таныс мысалда тағамның құрамындағы су молекулалары микротолқынды пеште микротолқынды сәулеленуді (инфрақызылдың ұзын соңындағы толқын ұзындығы) сіңіреді. Мұның оңай анықталатын нәтижесі - тағамның қызуы!

Бір кесе суға бір тамшы жасыл түсті тағамдық бояғышты, ал басқа кесе суға бір тамшы сары түсті тағамдық бояуды қосайық делік. Осы тағамдық бояғыштардың (бояғыштардың) әрқайсысы органикалық молекуланың әртүрлі түрі болып табылады. Осы екі ерітіндіні бөлек пробиркаларға салып, терезе жарығына қарсы ұстаңыз деп елестетіңіз. Сіз оларды әртүрлі түстер ретінде көресіз, өйткені ерітіндідегі бояғыш молекулалары жарықтың әртүрлі толқын ұзындығын сіңіреді (яғни сүзгіден өткізеді) және көзіңізге әртүрлі толқын ұзындығын береді (яғни өтуге мүмкіндік береді). Жасыл ерітінді жасыл болып көрінеді, себебі бояғыш молекуласының бұл түрі негізінен толқын ұзындығын сіңіреді жасылдан басқа. Сол сияқты, сары ерітінді сары болып көрінеді, өйткені ерітіндідегі молекулалар спектрдің сары бөлігіндегі толқын ұзындықтары болып табылады. сіңірмеңіз сондықтан ерітіндіден өткеннен кейін көзіңізге бірінші кезекте сары толқын ұзындығы жетеді. Осылайша, сапасы жұтылатын жарықтың (сапаның түрін, түрін білдіреді) түріне байланысты түрі еріткіште еріген молекуланың. Жасыл бояу мен сары бояу сияқты молекулалардың әртүрлі түрлері жарықтың әртүрлі түрлерін (толқын ұзындығын) сіңіреді.

The саны жұтылатын жарыққа байланысты шоғырлану жарықты жұтатын еріген еріген заттың. Егер сіз еріген заттың концентрациясын арттырсаңыз, берілген толқын ұзындығының көбірек сәулесі жұтылады. Азық-түлік бояуының мысалын қайта пайдалану үшін бір кесе суға екі тамшы жасыл бояу тек бір тамшы жасыл бояумен жасалған ерітіндіге қарағанда сәл тереңірек жасыл болып көрінетін ерітінді береді. Екі ерітінді де бірдей жасыл емес толқын ұзындығын жұтады, бірақ концентрлі ерітіндіде сіңірілген жасыл емес жарықтың мөлшері көбірек болады. Ерітінді арқылы жұтылатын (немесе жіберілетін) жарықтың сапасы мен саны арасындағы бұл айырмашылық биологияда маңызды: сапалық қасиеттері немесе құбылыстар (қандай түр немесе түр) қарсы сандық қасиеттері немесе құбылыстар (қанша/көп).

Зертханалық сынақтардың кейбір түрлерінде зерттеуші ерітіндідегі еріген заттар спектрдің қандай толқын ұзындығын жұтатынын білгісі келеді. Бұл еріген затты анықтауға көмектесуі мүмкін, өйткені молекулалардың әртүрлі түрлері әртүрлі толқын ұзындығын жұтады. Байланыстырылған бетте көрсетілген фотосинтетикалық пигменттердің сіңіру спектрлерін (спектрлер спектрдің көп түрі) қараңыз. Өмір, биология ғылымы, Purves және т.б., 5-ші басылым, 1998). Әрбір пигменттің толқын ұзындығының әртүрлі профилі бар екенін ескеріңіз, ол көп немесе аз күшті сіңіреді. Ол профиль «шыңдар» мен «алаңдардың» ізі және кейбір шыңдардың беткейлерінде «иықтары» болуы мүмкін. Жұтылу спектрі толқын ұзындығына (тәуелсіз айнымалы) байланысты жарық жұту графигі (тәуелді айнымалы) екенін түсініңіз. Қайтадан, жұтылған толқын ұзындығының сипаттамалық профилі (үлгі) негізінде молекуланың түрін анықтауға болады. Сіз мұны қаншалықты оңай жасауға болатынын көру үшін бүгінгі зертханада осындай сіңіру спектрін жасайсыз.

Зертханалық сынақтардың басқа түрлерінде зерттеуші ерітіндідегі белгілі бір еріген заттың концентрациясын анықтағысы келеді. Колориметрияны қолданудың бұл түрінде қызықты еріген заттың сіңіру спектрі анықталған. Сонымен, колориметрде еріген зат күшті сіңіретін толқын ұзындығын таңдаймыз. Жұтылу спектрлерінің графигіне қайта жүгінсек, фикоэритрин деп аталатын пигмент үшін 565 нм ең жақсы толқын ұзындығы болар еді. Бұл фикоэритриннің сіңіру спектріндегі ең жоғары «шыңның» толқын ұзындығының орны деп айта аламыз. Осы жасыл бояу мысалын енді қайта пайдалану үшін, бояудың әртүрлі концентрациясы бар сынақ түтіктерінің сериясы жасыл, бірақ жасыл түстің әртүрлі тереңдігімен көрінеді. Бұл ерітінділердің барлығы бірдей толқын ұзындығын, бірақ жарықтың әртүрлі мөлшерін сіңіретінін білдіреді. Сіздің көзіңіз түтіктер арасындағы жасыл тереңдіктегі салыстырмалы айырмашылықтарды көре алады, бірақ колориметр сіз үшін бұл айырмашылықтарды сандық түрде анықтайды, яғни сандық мәндерді қанша ерітіндіге түскен жарықтың сіңірілгені және қаншасы өткені. Ерітінді жұтатын берілген толқын ұзындығындағы жарықтың салыстырмалы мөлшері деп аталады сіңіру (A), ал ерітіндіге түсетін жарықтың кедергісіз өтетін бөлігі деп аталады пайыздық өткізгіштік (%T). Колориметрияның осы сандық аспектісін келесі аптада зертханада ерітінділердің ақуыз концентрациясын өлшеу үшін биурет процедурасын орындаған кезде қолданасыз.

Spectronic 20 колориметрі ішіндегі көрінетін спектрді бақылау

1. бұраңыз қуат қосқышы аспапты қосу үшін сағат тілімен шертуді естисіз/сезіңіз. The пилоттық шам жанып тұруы керек және ішіндегі салқындатқыш желдеткіштің нәзік дыбысын естисіз. Егер осы құралдардың бірінде пилоттық шам жанбаса, алаңдамаңыз. Әзірге құралдың алдыңғы жағындағы екі тұтқаның басқа қолданыстарын елемеуге болады.

2. Төмендегі құралдың суретін қараңыз. Сіз сынайтын әрбір ерітінді а деп аталатын шағын пробиркаға салынады колориметр түтігіішіне енгізілген үлгі ұстаушы. Қандай толқын ұзындығы таңдалса да, жарық шоғы ұстағыштағы түтік арқылы оңнан солға қарай өтеді.

3. Сынақ түтігінің сөрелерінде түтіктің ұзындығынан сәл қысқа және колориметр түтігіне ыңғайласатындай ені жеткілікті төртбұрышты ақ қағаз жолағы бар колориметрлік түтік бар. Бұл түтікті ұстағышқа салыңыз (оны толығымен төмен қарай итеріңіз) түтікке оң жақтан кіретін әлсіз жарық сәулесі қағаздың тегіс бетіне түсетіндей етіп бұраңыз.

4. Қолыңызды ашық үлгі ұстағыштың үстіңгі жағына айналдырып, түтікке мұқият қараңыз әлсіз қағаздан шағылысқан жарық. Көзіңізді тостаған қолыңызға жақын ұстауыңыз керек (түтіктің жоғарғы жағына жақын), себебі жарық әлсіз. Бөлме жарығы тым ашық болса, нұсқаушы бөлме шамдарын бір сәтке өшіреді.

5. Бұраған кезде толқын ұзындығын басқару тұтқасы, сіз қағаз шағылысқан жарықтың күлгін/көктен (шамамен 400 нм) жасылдан сарыға қызғылт сарыға және соңында қызылға (шамамен 700 нм) өзгергенін көресіз. Құралдың ішіндегі шам ақ жарық шығарады (барлық толқын ұзындығының қоспасы), бірақ толқын ұзындығын басқару тұтқасы сіз таңдағаннан басқасының барлығын экранға шығарады. Қалыпты жұмыс кезінде (яғни колориметрлік түтіктегі қағазсыз) сіз шағылған жарық сынақ ерітіндісі бар түтікке түседі және оның бір бөлігі түтіктің екінші (сол жақ) жағынан детекторға соқтығысады. бұл жарықты тіркелетін электрлік сигналға түрлендіреді өткізгіштік және сіңіру шкалалары.

6. Үлгі камерасынан түтікшені алып, оны пробирка сөресіне ауыстырыңыз.

7. Қалыпты жұмыс кезінде үлгі ұстағышының қақпағы сынама түтігін енгізгеннен кейін, өлшемдерді жазбас бұрын, адасқан жарықты өшіру үшін әрқашан жабылады.

Рибофлавиннің, витаминнің сіңу спектрін анықтау үшін колориметрді стандарттау

Жарық колориметрлік түтіктегі ерітінді арқылы өткенде, сол жарықтың кішкене бөлігі түтіктің шынысына және қызықты молекула еріген еріткішке жұтылуы мүмкін. Әрі қарай, келесі зертханалық жаттығуда (ерітінділердегі ақуызды өлшеуге арналған биурет сынағы) көретіндей, түтіктегі ерітіндіде сіз өлшейтін түсті шығару үшін қажетті басқа заттар болуы мүмкін. Молекулалардың көптеген түрлері боялмағандықтан, оларды өлшеу үшін колориметрді қолданар алдында олар түс беретін нәрсемен әрекеттесуі керек. Кез келген нәрсе жарықтың өтуі жарықтың бір бөлігін жұтып, өлшемдерге әсер етуі мүмкін. Мәселе ерітіндідегі молекуланың белгілі бір түрінің сіңірілуін өлшеу болғандықтан, барлық басқа заттардың (пробирканың шынысы, еріткіш, кез келген түс шығаратын) жарық сіңіруін түзету ("алып тастау") қажет. бар реагенттер). Мұны істеу үшін сіз құралды стандарттау өлшеулерді орындамас бұрын.

Рибофлавин - суда еритін витамин. Сөредегі түтіктердің біріндегі сары ерітіндіде суда ерітілген рибофлавин бар, 0,017 мг/мл басқа ештеңе жоқ. Рибофлавиннің сіңу спектрін анықтау үшін ең дәл мүмкін деректерді алу үшін шыны мен еріткіштің (бұл жағдайда су) жарықты сіңіруін түзету үшін колориметрді стандарттау керек. Сондықтан сізде тек су бар басқа түтік бар, яғни қызығушылық молекуласынан басқаның бәрі, рибофлавин бұл екінші түтік деп аталады бос. Құралды стандарттау үшін дайындаманы пайдаланасыз. Іс жүзінде сіз қызықтыратын молекула, рибофлавиннен басқа барлық нәрсенің жарық сіңіруін «құралға елемеуді» айтасыз.

Стандарттау қадамдары аз және қарапайым, бірақ олар орындалуы керек сенімді деректерді алу үшін дұрыс және мұқият.

1. Құрал әлі қосылмаған болса, сіз пайдаланар едіңіз қуат қосқышы құралды қосып, оны шамамен 15 минут қыздырыңыз.

2. пайдаланыңыз толқын ұзындығын бақылау тармағында көрсетілген толқын ұзындығының мәндерін қажетті толқын ұзындығын таңдау үшін түйме толқын ұзындығы теру дисплей терезесі нанометрмен (нм) өлшенеді. ЕСКЕРТУ: келесі аптадағы жұмыста сіз бүгін тек бір толқын ұзындығын пайдаланасыз, дегенмен рибофлавиннің сіңіру спектрін анықтау үшін көптеген толқын ұзындықтарында жарықтың жұтылуын өлшейтін боласыз. Сонымен, біз толқын ұзындығы үшін 340 нм-ден бастаймыз. Оны қазір орнатыңыз.

3. көмегімен үлгі ұстаушы бос және оның қақпағы жабық болса, пайдаланыңыз «0» басқару индикатор индикаторын өткізгіштік шкаласында 0 %T нөл пайызға орнату үшін тұтқаны (қуатты басқару тұтқасымен бірдей). Камерада түтік болмаса, камераға ешқандай жарық түспейді (ол жерде тым қара), сондықтан ешқандай жарық детекторға түспейді. Іс жүзінде, сіз аспапқа камерада ерітіндісі бар түтік болса, түтікке түсетін жарықтың ешқайсысы екінші жағына өтпесе, дәл осылай көрінетінін айтасыз, яғни жарықтың 0 %. жарық өтті.

4. Бос түтікті ұстағышқа салып, қақпақты жабыңыз. Ине %T шкаласы бойынша жоғары қарай сыпырылады. Ине қай жерде тоқтаса, оны пайдаланыңыз жарықты басқару инені шкаладағы 100 %T мәніне жылжыту үшін қазір түймені басыңыз. Шын мәнінде, сіз құралға камерадағы үлгі бар екенін айтасыз, бірақ рибофлавин жоқ, түтікке түсетін барлық жарық (оның 100%-ы) екінші жаққа өтіп кетсе, мынаны көресіз. Шыны мен еріткіш рибофлавин үлгісімен бірге болатындықтан, бұл қадам құралға осы факторлардың жарық сіңіруін елемеу керектігін айтады. Енді, егер сіз 100%-дан аз %T мәнін көрсеңіз, бұл рибофлавиннің рибофлавинмен жарықты сіңіруіне байланысты болуы керек, түтікке түсетін жарықтың 100%-дан азы өтеді.

5. Үлгі ұстағыштан дайындаманы алыңыз және қақпақты жабыңыз. Ине %T нөлге қайта түсуі керек.

6. Құрал енді 340 нм толқын ұзындығы үшін стандартталған. Егер сіз осы бір толқын ұзындығында көптеген үлгілер бойынша өлшемдер жасағыңыз келсе, сіз оған қол тигізбейсіз жарықты басқару тұтқасы немесе «0» басқару бұдан былай түйме.

Рибофлавиннің жұтылу спектрін анықтау

Абсорбциялық спектр графигі сіңіру (А), y осінде % өткізгіштік емес, x осіндегі толқын ұзындығының функциясы ретінде. Абсорбция - бұл колориметрдегі басқа шкала. Жұтылу және %T шкалаларының бірі көтерілгенде, екіншісі төмендегенде өзара байланысты екенін білдіретініне қарағанда, қарама-қарсы бағытта жүретінін ескеріңіз. Сонымен қатар %T шкаласындағы бөлімдер арасындағы аралықтарды ескеріңіз, ал жұтылу логарифмдік масштабқа ие (жалпы журнал, яғни 10 базалық журнал). Атап айтқанда, A = журнал (1 / Т), мұндағы T - %T санының ондық эквиваленті. Мысалы: %T = 50% болса, T = 0,5 және (1 / T) = 2,0 және A = 0,301. Осы алгебралық қатынасты түсінгеніңізге көз жеткізіңіз.

Рибофлавиннің сіңу спектрі үшін деректерді қазір жинау үшін сізге қажет сіңіру мәндерін жазып алыңыз көрінетін спектрде бір ғана емес, көптеген толқын ұзындығында. 5 нм қадамдармен өлшемдерді алу жеткілікті болады. Толқын ұзындығы өзгерген сайын, алайда, 100 %T параметрін қайта жасау керек, себебі шыны мен еріткіш әртүрлі толқын ұзындықтарында жарықты бірдей дәрежеде сіңірмеуі мүмкін. Бірақ бұл қосымша қадам аз уақытты алады. Сонымен, келесідей әрекет етіңіз.

1. 340 нм толқын ұзындығы үшін стандартталған колориметрмен рибофлавин түтігін салып, камераның қақпағын жабыңыз және сіңіру көрсеткішін жазыңыз. Ешбір түйме параметрлерін әлі өзгертпеңіз. Содан кейін рибофлавин түтігін алып, қақпағын жабыңыз. Ине 0 %T мәніне қайта түседі, бұл A = «шексіздік» (мүмкін болатын ең жоғары сіңіру). Сіз 0% T мәнін орнатыңыз тек бір рет.

2. Толқын ұзындығын соңғы параметрден 5 нм жоғары етіп қалпына келтіріңіз. енгізіңіз бос түтікшені жабыңыз, қақпақты жабыңыз және ине 100 % T мәніне дейін бармайтынын ескеріңіз. Өйткені түтіктің шыны мен суы әртүрлі толқын ұзындығында әртүрлі мөлшердегі жарықты жұтады. Сонымен, инені 100 % T қалпына қойыңыз жарықты басқару қазір түйме. Құрылғы енді жаңа толқын ұзындығы үшін стандартталған.

3. Бос түтікшені алып тастап, ине 0 %T (= максималды сіңіру) мәніне қайта түскенін қараңыз. Рибофлавин түтігін үлгі ұстағышқа салыңыз, қақпақты жабыңыз және жаңа толқын ұзындығы бойынша сіңіруді жазыңыз. Камерадағы рибофлавин үлгісі бар ешбір түймені реттемеңіз. Содан кейін рибофлавин түтігін алып, қақпағын жабыңыз.

4. Енді №2 және №3 қадамдарды қайталаңыз: толқын ұзындығын 5 нм қадаммен арттырыңыз, 100 %T қалпына келтіріңіз. бос орынмен, және рибофлавин ерітіндісі үшін жаңа сіңіру мәнін жазыңыз. Сіздің соңғы толқын ұзындығы параметрі 530 нм болады. Бұл процесс тез жүреді, бірақ оны мұқият жасау керек.

5. Бос пробирканы да, рибофлавин түтігін де пробирка сөресіне қайтарыңыз. Құралда үлгіні ешқашан қалдырмаңыз. Бұрау арқылы құралды өшіріңіз қуат қосқышы сағат тіліне қарсы шертуді естисіз/сезіңіз.

6. Деректеріңізді сызықтық масштабтары бар екі осі де бар графикалық қағазға салыңыз: у осінде сіңіру және x осінде толқын ұзындығы. Рибофлавиннің абсорбциялық максималды толқын ұзындығы қандай? Жұтылу спектрінің қанша «шыңы» бар? Нәтижелеріңізді зертханалық нұсқаушымен тексеріңіз.


Іс-әрекет I

Эвтрофикация туралы көбірек түсіну үшін сіз зертханалық эксперимент жүргізесіз (1-бөлім) және Silver Springs компьютерлік моделін пайдаланасыз (2-бөлім)

1-бөлім

Мәдени эвтрофикацияны азайтудың әлеуетті тәсілі - жоғары трофикалық деңгейдегі организмдердің балдырларды тұтынуы. Біз бұл мүмкіндікті пайдалана отырып зерттейміз Дафния, жасыл балдырлармен қоректенетін зоопланктон және балдыр түрі деп аталады Хорелла. Бұл әрекеттен алған ақпаратымыз пайдалы болғанымен, бұл су ортасында не болуы мүмкін екенін тым жеңілдетеді.

Біз а колориметр балдырлар популяциясын өлшеу. Колориметр жұтуды өлшейді, бұл арқылы өтетін жарық мөлшерін емес, ерітінді сіңіретін жарық мөлшерін. Балдырлар популяциясы көбейген сайын (балдыр жасушаларының саны) сіңіру қабілеті де артады. Бұл тікелей қатынас.

Процедура

  1. Екі кюветаны және тасымалдау тамшуырын алыңыз.
  2. Бір кюветаны тазартылған сумен толтырыңыз. Бұл кювета дайындама
  3. Дайындаманы колориметрге салыңыз және оны нөлге келтіріңіз. Бұл эксперимент үшін негізгі өлшемді қамтамасыз етеді. Бос кюветаны кейінірек пайдалану үшін сақтаңыз.
  4. Бір рет қолданылатын тамшуырды пайдаланып, екінші кюветаны толтырыңыз Хорелла балдырлар. Балдырларды кюветаның бойына біркелкі таратуға тырысу үшін тамшуырды пайдаланыңыз.
  5. 10 қосыңыз дафния кюветаға салып, колориметрдің көмегімен сіңіруді дереу өлшеңіз. Төмендегі кестеге оқуыңызды жазыңыз.
  6. Кюветаны колориметрден алып тастаңыз және оны 30 минут бойы алаңдатпай отыруға рұқсат етіңіз.
  7. 30 минуттан кейін бос кюветаны (тазартылған суы бар) қайтадан колориметрге салыңыз. Құрылғыны қайта нөлге келтіру үшін дайындаманы пайдаланыңыз.
  8. Бос кюветаны алып, балдырларды/Дафния кюветаны колориметрге салыңыз. Абсорбцияны өлшеп, төмендегі кестеге оқуды жазыңыз.

Сұрақтар

  1. 0-ден 30 минутқа дейін сіңіру қалай өзгерді? Сіңіру жоғарылады ма, төмендеді ме, әлде өзгеріссіз қалды ма?
  2. Сіңіру мәнінің өзгеруі концентрациясы туралы не айтады Хорелла? Ол өсті ме, азайды ма, әлде сол күйінде қалды ма?
  3. Сіңіру мәні мүмкіндігі сізге мінез-құлық туралы не айтады Дафния? Олар тұтынды ма Хорелла? Сіз қалай білесіз?
  4. Нағыз су экожүйесінде зоопланктон мәдени эвтрофикация мен балдырлардың гүлденуінің әсерін азайта алады деп ойлайсыз ба? Неліктен немесе неге жоқ екенін түсіндіріңіз.

2-бөлім

Енді сіз зертханалық тәжірибеде трофикалық өзара әрекеттесу мен мәдени эвтрофикацияны байқаған болсаңыз, бұл білімді компьютерлік модельге қолданыңыз. Күміс Springs экожүйесінің мәдени эвтрофикацияға сезімталдығын талдау үшін үлгіні пайдаланыңыз. Есіңізде болсын, балдырлар бірінші трофикалық деңгейде фотосинтетикалық өндіруші болып табылады. The Дафния екінші трофикалық деңгейде қоршаған ортадағы шөпқоректілердің бірі болар еді. Эвтрофикация жағдайын имитациялау үшін үлгідегі деңгейлерді өзгертіңіз. Модельдеу арқылы әртүрлі трофикалық деңгейдегі популяциялардың қалай өзгеретінін көру үшін графиктерді қараңыз.

Сұрақтар

Модельден алған нәтижелерге сүйене отырып, келесі сұрақтарға жауап беріңіз:

  1. Жоғары трофикалық деңгейлер төмендей бастағанға дейін экожүйе қолдау көрсете алатын өндірушілердің ең көп саны қандай?
  2. Симулирленген балдырлардың гүлденуінде қауымдастықтың тыныс алуымен не болады? Ол көбейе ме, азая ма, әлде сол қалпында қалады ма?
  3. Симулирленген балдырлардың гүлденуіндегі ыдыратушы популяциямен не болады? Ол көбейе ме, азая ма, әлде сол қалпында қалады ма? Неліктен?
  4. Балдырлардың гүлденуі жыртқыштардың қай тобына (қай трофикалық деңгейге) көбірек әсер етеді? Неліктен бұлай деп ойлайсыз?

Өзіндік қасиеттерін пайдалана отырып, балдырлардың өсуін бақылау

Жанармай құнының өсуі, сондай-ақ климаттық өзгерістердің әсері балама отын көздеріне деген қызығушылықты күрт арттырды. Балдырлардан биоотын өндіру - үздіксіз зерттеу саласы. Бұл зерттеудің негізгі элементі уақыт өте келе әртүрлі жағдайларда балдырлардың өсуін бақылауды қамтиды. Мұнда ерітіндідегі балдырлардың жарық шашырау (бұлдырлық) қасиеттерін немесе балдыр хлорофиллінің флуоресценциялық қозуын пайдалана отырып, әртүрлі балдыр штаммдарын бақылау үшін Synergy&trade H4 көп режимді микропластинді оқу құралын пайдалану сипатталған.

Кіріспе

Суспензия культурасындағы бір жасушалы организмдердің өсуін лайлану немесе жарық шашырауын өлшеу арқылы бақылауға болады. Жасушалар саны артқан сайын ерітінді бұлыңғыр немесе бұлыңғыр болады, өйткені ол арқылы өтетін жарық бар микроорганизмдер арқылы шашыраңқы болады [1]. Beer rsquos заңына бағынбаған кезде, жарықтың шашырауы ұлғайған сайын детекторға түсетін жалпы жарық сәулесінің пайызы азаяды және сіңіру ретінде жазылады. Жарық шашырауына негізделген жасуша суспензияларының мөлшерін алғаш рет шамамен 1900 жылы Лорд Рэйли сипаттаған. Жарық жұтылмайды, керісінше жасушаның ішіндегі молекулалар түскен жарықты дифракциялайды. Дифракцияланған жарықтың көп бөлігі детекторға апаратын оптикалық жолдан ауытқиды және оқырман оптикалық тығыздық ретінде жазады. Жарық шашырауынан жарық жоғалту дәрежесіне аспалы бөлшектер де, аспаптың оптикасының конфигурациясы да әсер етеді. Жасуша спецификалық эффекторларға мыналар жатады: жасуша өлшемі, мембрана құрамы, ішкі жасуша органелласының анатомиясы және жасуша тығыздығы. Құралдың оптикалық өлшемдері, мысалы, жұтатын материал мен детектор арасындағы қашықтық, фокустау линзаларының болуы немесе болмауы және сәуленің өлшемі барлығы &ldquolight шашырау&rdquo сигналына әсер етеді. Балдырлар сияқты фотосинтетикалық организмдерді хлорофилл көмегімен бақылауға болады. Бірнеше түрлі хлорофилл құрылымдары болғанымен, хлорофилл а барлық өсімдік түрлері арасында біркелкі таралады. Цианобактериялар мен балдырларда хлорофиллдің бірнеше басқа түрлері табылды, олар орталық сақина құрылымынан тыс бүйірлік тізбектерде ерекшеленеді. Хлорофилл түріне қарамастан сіңіру немесе флуоресценция арқылы анықтауға болатын молекула. Бұл қолданбалы жазбада біз тек жасушалардың ішкі қасиеттерін пайдалана отырып, қосымша реагенттерді қажет етпестен балдырлардың өсуін бақылау үшін 600 нм шамасында жарықтың шашырауын және хлорофилл негізіндегі флуоресценцияны тиімді пайдалануды көрсетеміз.

Материалдар мен тәсілдер

Chlorella vulgaris (2714) және Microcystis aeruginosa штамдарының екі түрлі изоляттары (LB2238 және LB2061) дақылдары Остиндегі Техас университетіндегі UTEX балдырлар мәдениеті жинағынан алынды. Қажет болған жағдайда жасушалар BG11, TAP және TP орталарында өсірілді.

BG11, TAP немесе TP ортасындағы балдыр жасушаларының дақылдары стерильді 250 мл Эрленмейер колбаларында бірнеше күн ішінде өсірілді. Суспензия дақылдары бөлме температурасында ұсталды және тұрақты жарықпен жарықтандырумен 100 айн/мин айналмалы шайқағыштың көмегімен араластырылды. Аликвоттар (200 &мл) алынып, Corning 3603 қара жақты мөлдір түбі бар пластиналарға тамызылды. Деректерді басқару үшін Gen5 және сауда деректерін талдау бағдарламалық құралының (BioTek Instruments, Winooski, VT) үзіліссіз кинетика мүмкіндігін [2] пайдаланып, сіңіру және флуоресценция өлшемдері Synergy H4 көп режимді микропластинаны оқу құралы (BioTek Instruments, Winooski, VT) арқылы жасалды.

Әрбір ұяшық түрінің жарық шашырауы және флуоресцентті калибрлеу қисықтары гемоцитометр көмегімен жасушаларды санау арқылы анықталған белгілі тығыздықтағы (жасушалар/мл) жасуша мәдениеттерін сериялық сұйылту арқылы жасалды. Содан кейін калибрлеу қисықтары 600 нм абсорбция өлшемдерін пайдаланып, ұяшық нөміріне қатысты ақпарат беру үшін интерполяцияланды.

Флуоресцентті және абсорбциялық спектрлік сканерлеу Synergy&trade H4 көп режимді микропластинаны оқу құралының монохроматорлары арқылы орындалды. M. aeruginosa 2061 дақылдарының сіңіру қабілеті 1 нм қадамдарымен 300 нм-ден 700 нм-ге дейін өлшенді және Gen5 деректерді талдау бағдарламалық құралының көмегімен сызылған. Флуоресценция спектрлері де сол дақылдарды пайдалана отырып анықталды. Шығару спектрі 500 нм-ден 850 нм-ге дейін 1 нм қадаммен бекітілген 440 нм қозу толқын ұзындығы арқылы анықталды. Қозу спектрлік талдау үшін эмиссия толқын ұзындығы 685 нм етіп орнатылды және қозу толқын ұзындығы 1 нм қадаммен 300 нм-ден 500 нм-ге дейін өзгерді. Екі сканерлеуге арналған деректер максималды 10 000 RFU мәніне қалыпқа келтірілді және Gen5&trade деректерді талдау бағдарламалық құралының (BioTek Instruments) көмегімен сызылған.

Нәтижелер

Балдырлар дақылдарының спектрлік сканерлеулері 400 нм-ден төмен маңызды жұтылуды, сондай-ақ 440 нм және 675 нм-де екі түрлі сіңіру шыңдарын көрсетеді (1-сурет). Жасуша санын анықтау жасуша құрамдас бөліктерінің сіңіруінен гөрі жарықтың шашырауын пайдаланған кезде ең дәйекті болады. Материалды сіңіруге әсер етпеу үшін өсуді бақылау үшін толқын ұзындығы ретінде 600 нм таңдалды.

1-сурет. Microcystis aeruginosa суспензия дақылдарының абсорбциялық спектрлік қисығы.

Жасуша суспензияларының мөлшері гемоцитометрдің көмегімен анықталды және сериялық сұйылтылды. Жасуша санына қарсы сызылған кезде жасушалардың жарық шашырауын көрсететін абсорбция өлшемдері сынақтан өткен барлық үш балдыр жасушаларының сызықтары үшін сызықтық қатынасты көрсетеді (2-сурет). Осы сияқты калибрлеу қисықтарын сіңіру көрсеткіші негізінде ұяшық санын анықтау үшін пайдалануға болады. Біз әр түрлі штаммдар мен ағзалар арасындағы сіңірумен әр жасуша негізінде сіңіру реакциясының айтарлықтай айырмашылығын байқадық (2-сурет).

2-сурет. BG11 орталарында өсірілген балдырлар штаммдары үшін калибрлеу қисығы жарықтың шашырауымен индукцияланған жұтылуды өлшеуге негізделген.

Флуоресцентті спектрлік сканерлеу балдырлар дақылдарына да жүргізілді. 3-суретте көрсетілгендей, хлорофилл а флуоресценциясының күтілетін шыңдарына сәйкес келетін қозу мен эмиссияның маңызды шыңдары байқалды. Қозу шыңы 434 нм-де байқалды, ал эмиссия шыңы 684 нм-де анықталды. Кейінгі флуоресцентті анықтаулар қозу толқын ұзындығы 440 нм және эмиссия толқын ұзындығы 685 нм пайдаланылды. Флуоресцентті өлшемдер балдыр жасушаларының сұйылтуларымен де жүргізілді. Флуоресцентті реакция сыналған балдырлардың барлық үш түрі үшін де жасуша санына қатысты сызықты екені анықталды (4-сурет). Жарықтың шашырауына негізделген жұту қабілеті де, хлорофилл флуоресценциясы да сызықтық және барлық үш балдыр штаммдарының реакциясы бірдей қатынасқа ие болғанын байқау анықтаудың кез келген әдісін жасуша өсуін бағалау үшін қолдануға болатынын көрсетеді.

3-сурет. Microcystis aeruginosa суспензия дақылдарының флуоресцентті қозуы және эмиссиялық спектрлік талдауы.

Бұл Chlorella vulgaris сұйылтуларының жеке микропластиналық ұңғымаларынан 600 нм абсорбентке қарсы 685 нм (440 нм қозу) флуоресценция графигін салғанда расталады. Екі өлшем арасындағы тікелей корреляция шашырау сызбасында сызықтық регрессия орындалғанда жоғары корреляция коэффициентімен (> 0,97) байқалады (5-сурет).

4-сурет. Calibration curves for algal strains grown in BG11 media based on fluorescence excitation of chlorophyll.

These data suggest that under the constant light illumination growth conditions used for these experiments either 600 nm absorbance based light scatter or fluorescence based chlorophyll determinations can potentially be used to monitor algal culture growth in suspension.

5-сурет. Correlation between absorbance and fluorescence measurements of Chlorella vulgaris dilutions.

When the growth of different algal strains in BG11 media is compared using absorbance at 600 nm in conjunction with the cell calibration curve strain to strain differences are observed (Figure 6). All three strains exhibit classical sigmoidal shaped growth patterns. An initial lag phase after inoculation where cells are adapting to the new environment and growing slowly, which is followed by a log-phase were cells are rapidly growing and dividing and as nutrients become scarce and metabolic by-products increase the cells enter a stationary phase.

As demonstrated in Figure 6 aliquots of all three strains increased in 600 nm absorbance until reaching stationary or plateau phase at approximately 10 days. C. vulgaris and M. aeruginosa 2383 resulted in very similar absorbance values, while M. aeruginosa 2061 plateaus at cell densities about one third of the other two strains of algae (Figure 6).

6-сурет. Comparison of cell number from different algal strains grown in BG11 media.

When fluorescence is measured in the same cultures a different pattern of cell growth than what was seen with absorbance is observed. As shown in Figure 7 cell density of the green algae C. vulgaris appeared to increase rapidly with little evidence of a lag phase. M. aeruginosa 2383 required a significantly longer period of time to reach maximal levels, while M. aeruginosa 2061 lagged behind even after 15 days. Despite the patterns being significantly different the basic relationship between the three strains was similar. M. aeruginosa 2061 signal for both absorbance and fluorescence was significantly less than the other two strains at the end of 15 days, while the maximal levels of M. aeruginosa 2383 and C. vulgaris were similar (Figure 7).

7-сурет. Comparison of fluorescence of Algal strains grown in BG11 media.

When cell number and fluorescence from the same cultures are plotted together and compared differences between the strains become apparent. With C. vulgaris cultures increases in chlorophyll as measured by fluorescence closely parallel increases in cell number as interpolated from 600 nm absorbance (Figure 8). This suggests that the amount of chlorophyll per cell remains relatively constant through the growth cycle.

8-сурет. Cell density (from absorbance measurements) and Fluorescence of Chlorella vulgaris culture in BG11 media.

In the M. aeruginosa cultures increases in fluorescence lagged behind increases in cell number (Figure 9). This suggests that the number of cells initially increases faster than the amount of chlorophyll resulting in less chlorophyll per cell. Only when the change in cell number rate begins to slow does the rate of chlorophyllincrease match that of cell number. Eventually both cell number and chlorophyll reach a steady state.

9-сурет. Cell density (from absorbance measurements) and Fluorescence of Microcystis aeruginosa 2383 culture in BG11 Media.

The nutritional effects of different media formulations can markedly influence the growth rate and final cell density of the algal cultures. C. vulgaris cultures grown in different media formulations, with varying amounts of total carbon, have markedly different final cell densities as measured by absorbance at 600 nm (Figure 10). Cultures grown in TAP, which has high amounts of carbon, grow to an absorbance density approximately 10 fold greater than cultures grown in BG11, which is carbon poor. Cultures grown in TP media, which has less carbon than TAP, have an intermediate final density. Interestingly, while maximal absorbance is less with TP media log phase growth of C. vulgaris begins sooner in TP media than TAP despite having less carbon initially (Figure 10).

Figure 10. Comparison of A600 growth curves of Chlorella vulgaris grown in different complete media formulations.

Carbon content is not the only critical constituent of algal growth media. C. vulgaris cultures grown in TAP media deficient in either nitrogen or sulfur grow at considerably slower rates and much lower final densities (Figure 11).

Figure 11. Comparison of A600 growth curves of Chlorella vulgaris grown in complete TAP media or TAP deficient in nitrogen or sulfur.

Талқылау

These data demonstrate the utility of monitoring algal cell growth using either absorbance of fluorescence. Assessment of cell density and growth state is a critical element in algae-based biodiesel production. The use of light scatter to measure suspended objects, such as cells, has been used for decades. While most often associated with bacterial cell growth, it has also been used for mammalian cells [1]. The basis of which is the diffraction of light by suspended moieties. A number of variables affect the amount of measured absorbance from a known concentration of cells. The size, shape and interior structure of the cells being monitored will affect the amount of light scatter. The physical make up of the microplate reader&rsquos optical path will also influence the absorbance reading when making light scatter measurements. Differences in light beam diameter, focal distance and detector size between different readers makes direct comparison of light scatter results difficult.

As such, for the most accurate results, it is necessary to generate calibration curves not only for each algal cell type, but for different instrument types. There are marked differences in the response between absorbance and cell number for different algal strains and species. As such, comparisons should employ the use of calibration curves to normalize the data on cell number. Comparisons of results within the same species can be accomplished without normalization on cell number. Any conversion would be the same for all data sets.

The constituents of the growth media are a critical variable in defining not only growth rate, but final cell density of algal cultures. Media formulations, such as TAP and TP containing relatively high carbon content are much better able to support rapid and dense algal cell growth than carbon poor media formulations such as BG11. Likewise, carbon rich growth conditions that lack other key elements such as nitrogen or sulfur also suffer from poor growth. These nutritional restrictions often result in decreases in protein or DNA synthesis as a result of the lack of key building block components [3].

Microalgae strains can have different growth patterns when inoculated at low concentration. C. vulgaris responds to inoculation by increasing cell number and chlorophyll content in parallel. This suggests that these cells maintain a constant amount of chlorophyll per cell. M. aeruginosa cultures increase in cell number much quicker than chlorophyll content, which indicates that initially the amount of chlorophyll per cell decreases. Only as the rate of increase in cell number slows does the amount of chlorophyll per cell increase. This suggests that M. aeruginosa uses media components rather than light as it preferred means to provide energy.

Quantitation of total protein has been used as a means to normalize cellular reactions for several decades based on the premise that on average, each cell has the same amount of protein Unlike animal cells in culture, most algae contains significant amounts of chlorophyll, which can easily be detected in vivo by its inherent fluorescence and can be used in lieu of measuring total cellular protein. Using this specific protein has the marked advantage of being non-invasive and nondestructive. As is the case with total cellular protein, cellular chlorophyll levels are not constant. Chlorophyll levels can change not only as cells grow and divide, but also in response to changes in light levels. Care should be taken when comparison of chlorophyll levels between cultures in different growth conditions are made.

There are advantages and disadvantages for the use of either light scatter absorbance-based or chlorophyll protein fluorescence-based measurements as a means to generate calibration curves in order to determine cell numbers from experimental cultures Light scatter measurements require separate curves for each cell type and each different reader. The calibration curves need only be made once or at most periodically to identify instrument drift over time. Values generated for each cell density will represent an average cell size from a spectrum in the specimen. Because absorbance measurements have a defined unit, comparisons from experiment to experiment are easily made. Fluorescence based calibration is often used if the instrument being used only has one read-mode and can provide greater resolution in terms of signal-change than absorbance, but suffers a number of drawbacks. Protein fluorescence is an average of not only cell size (larger cells will have more protein), but also that of cell expression (some cells have expressed more protein). In addition many algal cell types will express very little chlorophyll when grown in a high carbon environment. In addition, the lack of a defined standard for fluorescence makes all measurements relative rather than absolute. In essence, any comparison requires a calibration curve for each experiment. These issues have made the use of light scatter using 600 nm optical density measurements the preferred method to normalize and compare algal experimental data.

The Synergy&trade H4 Multi-Mode Microplate Reader is an ideal detection platform to monitor algal cell growth. The Synergy H4 has optics modules for absorbance, fluorescence and luminescence. Absorbance maxima, as well as fluorescence excitation and emission peaks can be identified using spectrum analysis. The ability to measure both absorbance and fluorescence on the same sample at the same time provides unique measurement flexibility. Cells number can be assessed using light scatter absorbance measurements at 600 nm or with chlorophyll detection by fluorescence. Because both measurements are non-invasive both can be performed on the same samples in microplates. In addition, microplates not only offer the ability to measure samples in small volumes, but the flexible array of wells density (6-, 12-, 24-, 48-, 96-, 384-, and 1536-) allows the researcher to choose the best reaction volume and sample number combination to suit their needs. Because microplates have industry defined and accepted geometries, automation can easily be employed for many routine measurements.


Enzymes in Action- Quantifying Milk Proteins

Trypsin is an enzyme which hydrolyses proteins into peptides, ready for other enzymes to cut them further down to their amino acids for use in the body. Enzymes are catalysts, which means they help or cause a reaction to occur without being consumed themselves. Trypsin works in the small intestine, after acid and pepsin in the stomach have commenced the work of breaking down the proteins.

This experiment uses milk which contains the protein casein. As the casein in milk break down, the smaller molecules become soluble, thereby reducing the opacity of the fluid. The time taken to break down the molecules can be measured and comparison of known values against unknown values will allow the unknowns to be calculated. As the milk will not become entirely clear due to the inevitable presence of fat, some error will be introduced by varying decisions of the endpoint, not only amongst the class but each student may have their own inconsistencies. A colorimeter in transmittance mode may be used instead to reduce this type of error, however the visual assessment should be enough to demonstrate the basic principle. This experiment starts with known concentrations of skim milk powder. The concentration of protein itself can be calculated if you wish, from the information on the packet of milk we have found skim milk generally contains around 9g of protein per 25g of powder (36%).

PREPARATION : LAB TECHNICIAN

  1. Dissolve 30g of milk powder in 250mL of distilled water (dH2O)
  2. Add distilled water to make 300mL for a 10% stock solution. (Adjust as appropriate for your class size &ndash 300mL of stock should be enough for 12 groups with allowance for spillage). Dilute as follows:
        • 5% standard &ndash 75mL of stock in 75mL of dH2O
        • 4% standard &ndash 60mL of stock in 90mL of dH2O
        • 3% standard &ndash 45mL of stock in 105mL of dH2O
        • 2% standard &ndash 30mL of stock in 120mL of dH2O
        • 1% standard &ndash 15mL of stock in 135mL of dH2O
        1. Use the remaining milk to create two unknown samples (X and Y) within the range 1-5% eg 47mL of stock in 103mL of dH2O and 28mL of stock in 122mL of dH2O. Keep note of the concentration but do not reveal to students.

        Trypsin stock solution:

        1. Dissolve 1g Trypsin in 100mL dH2O to make a 1% solution.
        2. Run a quick assay (see method below) to make sure that the 5% protein standard will take about 2-3 minutes to the end point.
        3. If the timing is appropriate, dissolve 4g Trypsin in 400mL dH2O to make the remainder of your 1% solution. If it&rsquos too fast or too slow, adjust the dilution appropriately.

        METHOD: STUDENT ACTIVITY

        1. Label your test tubes 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, X and Y.
        2. To each tube add 10mL of the appropriate milk solution.
        3. Mark a black cross, approximately the size of the diameter of your test tubes, on the white paper.
        4. To the first tube (1%) add 5mL Trypsin solution. Start the timer and shake gently to mix. If you are wearing gloves, you may prefer to hold your thumb over the top of the tube and mix by inverting the tube, taking very good care that you have covered the top completely.
        5. Hold the cross behind the test tube and record the time it takes for it to become just visible.
        6. Repeat with the remaining tubes &ndash keep consistent the point at which you determine the cross to be visible.
        7. Plot your results for the standards on your graph paper to more easily check for anomalies. If any result seems out of place and you need to re-run that standard, it is best to use clean test tubes as the enzyme can be difficult to clean out. If you need to re-use a tube, first place the 5mL of Trypsin and start your timer from when you add the milk.
        8. Once you are satisfied that your calibration curve makes sense, plot the results for your two unknowns to estimate the concentration of milk in each.
        9. The class results are to be collated and averaged out to make an aggregate calibration curve and estimate. Consider what you expect to see from aggregate results compared to individual.

        OBSERVATIONS AND RESULTS

        Below is an example of expected results. It is a guide only as individual results will vary.


        The bluest of blue: A new algae-based switch is lighting up biological research

        Several organisms possess "ion channels" (gateways that selectively allow charged particles called ions to enter the cells and are integral for cell function) called "channelrhodopsins," that can be switched on and off with the help of light. Different channelrhodopsins respond to different wavelengths in the light spectrum. These channels can be expressed in foreign organisms (animals even in human) by means of genetic engineering, which in turn finds applications in optogenetics, or the application of light to modulate cellular and gene functions. So far, the shortest wavelength that a channelrhodopsin responds to was blue.

        However, recently, a group of scientists from the Nagoya Institute of Technology, Japan, and Jawaharlal Nehru University, India, have identified a channelrhodopsin that responds to an even shorter indigo blue wavelength of light. In their study published in Nature's Communications Biology, the group of researchers, led by Professor Hideki Kandori and Associate Professor Satoshi P. Tsunoda, identified a novel channelrhodopsin, which they named KnChR, from a species of terrestrial alga called Klebsormidium nitens. "We chose this alga, because it is known to be responsive to light, but its photoreceptor domain has not been established," reports Prof. Kandori. Unlike other discovered channelrhodopsins, KnChR was found to respond to indigo blue light.

        It is known that KnChR is made up of a seven-cell membrane spanning region, which forms the pore that allows the entry and exit of different ions. This region is followed by a protein moiety including a peptidoglycan binding domain. In order to investigate the properties of KnChR, the researchers performed extensive genetic and electrophysiological experiments.

        What was perhaps the most exciting result was that they could identify the role of the "cytoplasmic domain." All known channelrhodopsins have a large "cytoplasmic domain," or region that is located in the internal area of the cell. As Prof. Kandori explains, "All currently known channelrhodopsins comprise a large cytoplasmic domain, whose function is elusive. We found that the cytoplasmic domain of KnChR modulates the ion channel properties."

        Accordingly, the results of the experiments showed that changing the lengths of the cytoplasmic domain caused the changes in ion channel closure. Particularly, the shortening of the domain resulted in increased channel 'open time' by more than ten-fold. In addition, the researchers also identified two arginine amino acid residues, namely R287 and R291, in the same region, which played an important role in the properties of generated light currents. They found that KnChR exhibited maximal sensitivity at 430 nm and 460 nm, making it the 'bluest' channelrhodopsin.

        Overall, the researchers have faith in the KnChR being helpful in biological systems requiring specific excitation parameters. When asked about the implications of these findings, Prof. Tsunoda, who is the corresponding author of the study suggests, "KnChR would expand the optogenetics tool kit, especially for dual light applications when short-wavelength excitation is required." What this means is that the light-operated property of KnChR can be applied in targeted manipulation of an organism's biological functions, in a research setting. A few examples would include manipulation of neuronal and myocyte activities.


        Эксперименттік

        Preparation of the Original Fe Solution

        To an accuracy of ± 0.1 mg weigh out enough ferrous ammonium sulfate, Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 6H 2 O, gfw = 392.14, to prepare 250 mL of a solution which is 0.00200 M with respect to that compound. Quantitatively transfer the salt into a 250 mL volumetric flask, add sufficient water to dissolve the salt, add 8 mL of 3 M H 2 SO 4 , dilute to the mark with distilled water and mix well. We shall call this the Stock Fe Solution. Pipet 10 mL of this solution into a 100 mL volumetric flask, add 4 mL of 3 M H 2 SO 4 and dilute to the mark with distilled water and mix well. Label this solution as Original Fe Solution and calculate the concentration of Fe, in ppm, in this solution.

        Measurement of the Absorbance Spectrum

        In order to determine the wavelength of maximum absorbance it is necessary to obtain the absorbance spectrum of the iron-bipyridyl complex. Readings taken at 10 nm intervals are sufficient to outline an absorbance spectrum except perhaps at absorbance peaks where additional points may be required to characterize the curve more completely. Pipet 10 mL of the Original Fe Solution into a 50 mL volumetric flask. Into a second 50 mL volumetric flask do not add any of the iron solution, but add about 10 drops of 3 M H 2 SO 4 . Then, in the order stated, add to each flask 1 mL of 10% hydroxylamine hydrochloride solution, 10 mL of 0.1% bipyridyl solution and 4 mL of 10% sodium acetate solution. The purpose of the sodium acetate is to buffer the mixture. The sodium acetate plus the sulfuric acid already present gives an acetic acid-acetate buffer in the pH region of about 4.5 to 5. Be sure to mix well after the addition of each reagent. Then fill each flask to the mark with distilled water and mix well by inverting and shaking. The flask containing iron has the same concentration as the Standard Fe Solution which will be prepared in the next section. Now take absorbance readings for this solution from 400 nm to 600 nm, in intervals of 10 nm, except where additional points are needed better to define the shape of the curve. Use the solution not containing Fe as a blank. Neatly plot the absorbance (vertical axis) against wavelength (horizontal axis) on a piece of millimeter graph paper. Use the long side of the paper as the horizontal axis. From this graph select the wavelength which exhibits the maximum absorbance. That is the wavelength to be used for the measurement of the unknown solution. It is called lambda (max).

        Determination of the Absorbance of the Standard Fe Solution.

        Before beginning this part of the procedure be sure to record the number of the colorimeter that you are using for this part of the analysis. The number of the colorimeter is found on a small blue tag on the front of the colorimeter. A11 further absorbance measurements must be made with the same colorimeter and the same cuvettes in order for this method to work. Discard both of the solutions in the 50 mL volumetric flasks. Thoroughly rinse both volumetric flasks and then prepare a new set of solutions from the Original Fe Solution using the same amounts according to the previous procedure. Label the solution containing the Fe as Standard Fe Solution and calculate its Fe concentration in ppm. Determine the absorbance of this solution at the wavelength of maximum absorbance previously determined. For a blank use the solution which does not contain Fe. Make at least three measurements. In each case reset the zero and the 100% transmission. Record both the percent transmission and absorbance values. Empty your cuvette and refill it with another portion of the same solution and again determine the absorbance value. Calculate the average of all six absorbance values.

        Analysis of the Fe Unknown

        Clean a 100 mL volumetric flask, place your initials on the ground glass area and hand it to your instructor who will pipet 10 mL of unknown solution into it and who will also give you an unknown number for it. Then add 4 mL of 3 M H 2 SO 4 , mix well and then make up to the calibration mark with distilled water. Mix well by inverting and shaking the stoppered flask. Label this solution as First Unknown Dilution (FUD). Pipet 10 mL of this solution into a 50 mL volumetric flask and then in this exact order add 1 mL of 10% hydroxylamine hydrochloride solution, 10 mL of 0.1% bipyridyl solution and 4 mL of 10% sodium acetate solution. Be sure to mix well after the addition of each reagent, by gently shaking or swirling, but not inverting, the flask. After all reagents have been added fill the flask to the mark with distilled water and mix well by inverting and shaking. This solution will be called the Second Unknown Dilution (SUD). Determine the absorbance of the this solution using the previous blank solution as the reference and the wavelength of maximum absorbance determined earlier. Measure the absorbance at least three times. Empty the cuvette and refill it with another portion of solution and again determine the absorbance.

        Analysis of city tap water

        If samples of city tap water are supplied in this experiment, you will determine the iron concentration in two samples. The concentration of iron in city tap water approaches the level of precision of this method because the concentration of iron in most water of southern California is very low. Iron pipes offer the most abundant source for the iron in our water. The K sp of Fe(OH) 3 is 4.0 x 10 -38 . Calculation yields a concentration of Fe 3+ in neutral water to be so low as to be undetectable -- on the order of one part iron per one quintillion parts of water (10 -18 ). Still, whatever iron that finds its way into our water supply may end up in the form of a colloidal precipitate of ferric hydroxide. To bring that small amount of iron into solution we acidify tap water and boil it for two minutes, cool it to room temperature in ice and carry out the procedure now familiar to you.

        Процедура

        The absorbance you observe may be lower than that which you observed for your known and unknown samples. If you have really low absorbance readings, a slight difference in the shape of two cuvettes is enough to make detection of the presence of any iron impossible unless a correction for the systematic error between the two cuvettes is taken into account. Clean two cuvettes and fill both with the blank solution. Calibrate the spectrophotometer using one, then take an absorbance reading with the other. Make sure that the vertical line on the cuvettes is adjacent to the mark on the plastic cuvette holder in the spectrophotometer for both the calibration and all future readings. If the vertical line is in a different position during any reading, the absorance will change slightly. The second cuvette will be the one in which you place your sample. We will call this absorbance A systematic error . The absorbance you measure is the systematic error between the two cuvettes, using the first cuvette as the blank. This absorbance will be subtracted from the readings you get using the iron samples, as follows: Using a 50 mL graduated cylinder, obtain two samples of city tap water, 50 mL each, from two different cities. Place each sample in a clean 250 mL beaker. Add 10 drops of 3 M H2SO4 to each. Boil each sample on a hot plate for 2 minutes. Cool the two samples in ice until they are no longer warm to the touch. Pour each in turn back into the 50 mL graduated cylinder and add enough distilled water to bring each back to 50 mL volume. Pour contents of each into the same 250 mL beakers to mix. Pipet 35 mL of the first sample into a 50 mL volumetric flask (use a 25 mL volumetric pipet and a 10 mL volumetric pipet), then in this exact order add 1 mL of 10% hydroxylamine hydrochloride solution, 10 mL of 0.1% bipyridyl solution and then finally, using an eye dropper, add up to 4 mL of 10% sodium acetate solution to the mark. Be sure to mix well after the addition of each reagent, by gently inverting the flask. This sample will be called the city reaction flask in the description of calculations below. Determine the absorbance of this solution using the previous blank solution as the reference at the wavelength of maximum absorbance determined earlier. Measure the absorbance at least three times. Repeat this section with the second boiled sample of tap water from a әртүрлі city. Subtract the absorbance which represents the systematic error between the cuvettes from each of these experimental values.

        The calculation of the Fe concentration of the unknown can be made by a comparison method. This, however, can only be done if the system adheres to Beer's Law in the range of concentrations involved. In the case of the iron-bipyridyl complex that range is 0.5 to 8 ppm. The appropriate relationship for the calculation of the Fe concentration in the Second Unknown Dilution is:

        "A" is the absorbance, the subscript "S" refers to the absorbance and concentration, respectively, of the Standard Fe Solution while the subscript "SUD" refers to the absorbance and concentration of the Second Unknown Dilution. For the absorbance value of the unknown solution use the average of the three readings obtained for each sample taken. From the value obtained for [Fe] SUD , calculate the concentration of iron, in parts per million, of the original unknown Fe solution given to you by your instructor.

        If city water was provided for this experiment, the equation above is used to determine [Fe] for the solution whose absorbance you measured. Since this solution was made to 50 mL but in the process you used 15 mL of reagents prepared with distilled water, [Fe] for the city water can be found through a simple modification of the equation above:


        Colorimetry, turbidity, and spectrophotometry meters for water analysis

        You can choose from 134 preprogrammed methods to measure the concentrations of sample components with our colorimetry meters. These portable meters can go with you anywhere to test drinking water or wastewater

        Take your portable turbidity meter to the source for on-site measuring. Our turbidity meters feature white and infrared light sources allowing you to meet regulatory methods.

        Achieve simple and efficient water and wastewater analysis with our UV-Vis and Vis spectrophotometers. These meters include over 260 preprogrammed methods using common reagent chemistries, making them the ideal instruments to include in your laboratory.


        Activity I

        To understand more about eutrophication, you will conduct a laboratory experiment (Part 1) and use the Silver Springs computer model (Part 2)

        Part 1

        One potential way to decrease cultural eutrophication is by having higher trophic level organisms consume the algae. We will investigate this possibility using Daphnia, a zooplankton that feeds on green algae, and an alga species called Chorella. Although the information we gain from this activity is useful, it is an over simplification as to what might really occur in the aquatic environment.

        We will use a colorimeter to measure the algae population. A colorimeter measures absorbance, the amount of light that is absorbed by a solution rather than the amount of light that can pass through. As the algae population increases (number of algae cells), the absorbance will also increase. It is a direct relationship.

        Процедура

        1. Obtain two cuvettes and a transfer pipette.
        2. Fill one cuvette with distilled water. This cuvette is the blank
        3. Place the blank into the colorimeter and zero it. This provides a baseline measure for the experiment. Save the blank cuvette for later use.
        4. Using the disposable pipette, fill the second cuvette with the Chorella algae. Use the pipette to try and disperse the algae evenly throughout the cuvette.
        5. Add 10 daphnia to the cuvette and immediately measure the absorbance using the colorimeter. Record your reading in the table below.
        6. Remove the cuvette from the colorimeter and allow it to sit, undisturbed for 30 minutes.
        7. After 30 minutes, place the blank cuvette (with distilled water) back into the colorimeter. Use the blank to re-zero the machine.
        8. Remove the blank cuvette and put the algae/Daphnia cuvette into the colorimeter. Measure the absorbance and record your reading in the table below.

        Сұрақтар

        1. How did the absorbance change from time 0 to time 30 minutes? Did the absorbance increase, decrease, or stay the same?
        2. What does the absorbance value change tell you about the concentration of the Chorella? Did it increase, decrease, or stay the same?
        3. What does the absorbance value chance tell you about the behavior of the Daphnia? Did they consume Chorella? How do you know?
        4. In a real aquatic ecosystem, do you think zooplankton could decrease the impact of cultural eutrophication and algae blooms? Explain why or why not.

        Part 2

        Now that you have observed trophic interactions and cultural eutrophication in a lab experiment, apply that knowledge to the computer model. Use the model to analyze the sensitivity of the Silver Springs ecosystem to cultural eutrophication. Remember that alga is a photosynthetic producer on the first trophic level. The Daphnia would be one of the herbivores in the environment on the second trophic level. Change the levels in the model to simulate a eutrophication situation. View the graphs to see how the different trophic level populations change through the simulation.

        Сұрақтар

        Based on your findings with the model, answer the following questions:

        1. What is the maximum number of producers the ecosystem can support before higher trophic levels begin to decline?
        2. What happens to community respiration in the simulated algae bloom? Does it increase, decrease, or stay the same?
        3. What happens to the decomposer population in the simulated algae bloom? Does it increase, decrease, or stay the same? Неліктен?
        4. Which group of carnivores (which trophic level) is more greatly impacted by the algae bloom? Неліктен бұлай деп ойлайсыз?

        Algal Ball Photosynthesis

        In eukaryotic cells, specialised organelles facilitate biochemical processes of photosynthesis, cellular respiration, the synthesis of complex molecules (including carbohydrates, proteins, lipids and other biomacromolecules), and the removal of cellular products and wastes (ACSBL049)

        Фон:

        During photosynthesis, radiant energy is converted into organic substances that can be stored within the plant to support growth, reproduction, and metabolism. Plants metabolise the sugars that form as a result of sunlight, Carbon Dioxide, and water reacting. Reliably studying photosynthesis first hand can be difficult and require precise setting up. Algal ball photosynthesis kits offer an easier, more accurate method of studying photosynthesis that is perfect for use within the classroom. Algal balls are stored in small vials filled with Hydrogen Carbonate indicator solution. When exposed to light, the encapsulated algae absorb the CO2 from the solution they are stored in during the process of photosynthesis. As a result of the lowered CO2 levels, the pH of the solution will rise. When no light is available, respiration will dominate and the pH will decrease through the release of CO2. Changes in the levels of carbonic acid can be monitored via the colour changes that occur due to the hydrogen carbonate indicator.

        In this practical, students have the opportunity to tangibly observe photosynthesis. They are tasked with observing how the colour changes from yellow/orange to purple when the algal balls and solution are placed under a light source as photosynthesis takes up dissolved CO2 and the pH rises. Additionally, students create a light filter to test whether the wavelength of light affects their photosynthetic rate. This is a great practical to introduce students to the basic principles of photosynthesis in a fun, simple and interactive way.

        PREPARATION- LAB TECHNICIAN

        Making Algal Balls (If making your own algal balls)

        1. To make a 3% solution of sodium alginate, add 3g sodium alginate to 100mL of distilled water in an Erlenmyer flask. Stir continuously for at least 4 hours, or overnight using a magnetic stirrer. Do not apply any heat.
        2. To make 500mL of 2% calcium chloride, add 10g of calcium chloride to 500mL of distilled water and stir to dissolve.
        3. To prepare chlorella culture: Once your chlorella culture has grown enough to be a bright to darkish-green, siphon out as much of the denser areas into a measuring cylinder. Leave the culture to rest overnight to allow the algae to settle to the bottom of the cylinder. After this time, there should be a dark &ldquoplug&rdquo of dense algae at the bottom.
        4. To prepare chlorella alginate solution, take note of the volume of the plug, then carefully remove the supernatant until it accounts for 2/3 of the total volume in the measuring cylinder, with 1/3 dense alginate. For example, if you have 10mL of chlorella down the bottom, remove all but 20mL of supernatant so that you are left with 30mL in total. Keep the supernatant aside. If the mixture is too thick later to drop easily through the syringe, then you can use this to thin it out a little. Mix the remaining chlorella and supernatant in the measuring cylinder and add to an equal volume of your sodium alginate, e.g., 30mL of chlorella and 30mL of alginate to make 60mL altogether.
        5. To set up retort stand apparatus, attach a 30mL syringe barrel to the retort stand clamp so that the outlet is pointing downwards. Position the syringe barrel over a beaker of calcium chloride solution.
        6. To make algal balls, transfer your algae/alginate mix to the syringe, and allow it to drop through into the solution. Check the rate of the drops and the shape of the balls as they fall to the bottom.
                • If the rate is slower than a drop or two per second, add a small amount of the supernatant.
                • If the balls flatten on entering the liquid, the syringe is too high and should be lowered.
                • If the mixture comes through the syringe is too low, you may end up with &ldquosausages&rdquo of algae rather than balls.
        7. Algal Ball Culture Care (If you purchase the algal balls)

          1. The algal balls will arrive stored in a container of distilled water.
          2. The Chlorella within the balls is alive and therefore needs light to stay active. We recommend that you leave the balls in the container that they arrive in, and that you place this vial in a well lit area until required. Do not place in direct sunlight, nor expose to hot light sources, as the heat will be detrimental.
          3. It will also help to loosen the lid of the container to allow air access.
          4. Use the algal balls as early as you can otherwise, they are best used within 2 weeks.

          Vial Preparation

          Rinse the vials for your experiment using hydrogen carbonate indicator solution. To do this, add

          METHOD-STUDENT ACTIVITY

          1. Separate the algal balls from the surrounding liquid using the strainer. To do this, pour the algal balls into a strainer over a small beaker.
          2. Use the spoon to place an equal number of balls into each dram vial.
          3. Using a plastic pipette, fill all the vials with the hydrogen carbonate indicator. Make sure the caps are secured.
          4. Keep one vial to act as your control.
          5. Wrap a different piece of coloured cellophane around the other three vials.
          6. Place each vial approximately 10 cm away from your light source. Make sure the vials do not get hot.
          7. Copy the results table into your logbook and complete column A by comparing the colour of the hydrogen carbonate indicator to the set of pH standard solutions. You can use the image below (Figure 1) as a guide if standards are not available, however comparing the colour of the liquid in your vials to actual pH standard solutions will provide the most accurate results.
          8. After 40 minutes complete column B of the results table by comparing the colour of the hydrogen carbonate indicator to the set of standard references.
          9. Complete the final column of the results table by subtracting the amount in column A from the amount in column B.

          OBSERVATION AND RESULTS

          After exposing the vial to a light source, the colour in the solution should change from yellow/orange to purple as photosynthesis absorbs the CO2 and the pH rises. The pH of vials wrapped red, blue or purple cellophane will experience a greater rise than vials wrapped orange, yellow or green. This is due to the way the algae absorb light - we observe them as green because that is the colour that bounces off them out of the spectrum that makes up white light and so that is the colour that is not used in photosynthesis. Some change should be expected by the end of the class, however if it is too slight to notice you can return at the end of the day or the next day to check your vials.

          ТЕРГЕУ

          • Carbon dioxide dissolved in water forms carbonic acid. Hydrogen carbonate indicator is used to measure the acidity of a system. The pH of the system is low (yellow) when there is a lot of dissolved CO2. CO ретінде2 is removed, the pH rises and the colour becomes purple. Use this information to construct a bar graph of CO2 changes as a function of wavelength.
          • Why do we include a control in the experiment? What does this control represent in term of light wavelength?
                • The control represents all of the wavelengths of light, as it is not obscured by a colour filter. This control is used to compare the level of photosynthesis that takes place in the vials. All three vials are placed under the same conditions, to see whether the colour filters slow down photosynthesis or block usable wavelengths entirely.
                    • Both photosynthesis and respiration are happening all of the time, with photosynthesis dominating when light is available and respiration dominating in the absence of light. During photosynthesis, carbon dioxide and water plus the energy from light synthesise glucose and oxygen. As carbon dioxide is used up, carbonic acid in the water is converted to carbon dioxide, raising the pH of the water.
                    • During respiration, glucose is broken down along with oxygen to make carbon dioxide and water. As carbon dioxide enters the water, excess molecules are converted to carbonic acid, lowering the pH of the water.

                    EXTENSION EXERCISE

                    • Light availability is another factor that affects photosynthesis. Design an experiment to test how distance from light effects the rate of photosynthesis.

                    TEACHER TIP

                    Уақыт талаптары
                    Material List
                    Safety Requirements
                    1. Wear appropriate personal protective equipment (PPE).
                    2. Know and follow all regulatory guidelines for the disposal of laboratory wastes.

                    Avoid direct contact with any culture.

                    Reference Kits