Ақпарат

3.2: Табиғи және табиғи емес топтар - Биология


Түрді табиғи топ ретінде қарастыруға болатынын қайталай кеткен жөн, классификацияның жоғары деңгейлері биологиялық маңызды ақпаратты көрсетуі немесе көрсетпеуі мүмкін. Біз бір кітапты оқып, бір ағзаны зерттеп жатқанымызға сенімді бола аламыз!

Genera және басқа жоғары деңгейдегі классификациялар әдетте бір немесе бірнеше белгілерді басқаларға қарағанда маңыздырақ деп санау шешіміне негізделген. Белгілі бір мәнді белгіге беру ерікті болып көрінуі мүмкін. Мысалы, қасқырлар мен қасқырларды қамтитын Canis тұқымдасын және түлкілерді қамтитын Vulpes тұқымдасын қарастырайық. Бұл екі топ арасындағы айырмашылық Canis-пен салыстырғанда Вулпестегі кішірек және жалпақ бас сүйектерге негізделген. Енді жолбарыстар, арыстандар, ягуарлар және қабыландарды қамтитын қарапайым үй мысықтары Фелис тұқымдасын және пантера тұқымдасын қарастырайық. Бұл екі тұқым бас сүйектерінің ерекшеліктерімен және (Патера) немесе жоқ (Феликс) айқайлау қабілетімен ерекшеленеді. Сонымен, біз бұл айырмашылықтар туралы не айтамыз, олар нақты топтарды ақтауға жеткілікті ме, әлде Канис пен Вуплесті (және Феликс пен Пантераны) біріктіру керек пе? Бұл топтардың арасындағы айырмашылықтар биологиялық мағынаға ие ме? Жауап мынада: көбінесе жоғары дәрежелі жіктеулердің негізі биологиялық тұрғыдан маңызды емес. Биологиялық маңыздылықтың бұл жалпы жетіспеушілігі организмнің жоғары дәрежелі жіктелуінің өзгеруі мүмкін екендігімен атап өтіледі: тұқым тұқымдас болуы мүмкін (және керісінше) немесе түрдің бір тұқымдастан екіншісіне ауысуы мүмкін. Аюлар деп аталатын организмдердің түрлерін қарастырыңыз. Аю тәріздес ағзалардың әртүрлі түрлері бар, бұл факт Линнейдің жіктеу схемасы мойындады. Аю тәріздес ағзалардың барлығына қарап, біз сегіз типті танимыз.59 Қазіргі уақытта біз олардың төртеуін, қоңыр аюды (Ursus arctos), азиялық қара аюды (Ursus thibetanus), американдық аюды (Ursus americanus) және ақ аюды (Ursus maritimus) бір-біріне айтарлықтай ұқсас деп санаймыз. аюлардың басқа түрлеріне қарағанда әртүрлі белгілердің болуы. Сондықтан біз оларды Урсус тұқымдастарына орналастырдық. Біз аю тәрізді организмдердің басқа түрлерін, көзілдірікті аюды (Tremarctos ornatus), жалқау аюды (Melurus ursinus), күн аюын (Helarctos mayalanus) және алып панданы (Ailuropoda melanoleuca) жеке-жеке бөлек орналастырдық. тұқымдас, өйткені ғалымдар бұл түрлерді Ursus тұқымдастарына қарағанда бір-бірінен ерекше деп санайды. Мәселе мынада, бұл айырмашылықтар жаңа тұқымға кепілдік беру үшін қаншалықты үлкен болуы керек?

Сонда бұл бізді қайда қалдырады? Мұнда жасуша (тіршіліктің үздіксіздігі) теориясымен бірге эволюция теориясы біріктіріледі. Біз екі түр неғұрлым жақын (эволюциялық) болса, соғұрлым олар ортақ белгілерге ие болады және жаңа, биологиялық маңызды белгінің дамуы топты екіншісінен ерекшелендіреді деген болжаммен жұмыс істейміз. Рационалды жіктеу схемасының негізінде жатқан белгілер синапоморфиялар (техникалық термин) деп аталады; негізінен бұл тұқымдық ағаштың бір немесе басқа тармақтарында пайда болған және сол тармақты анықтауға қызмет ететін белгілер, бір бұтақтағы организм басқа бұтақтағылардан (тектік) ерекшеленетін «табиғи» топтың бөлігі болып табылады. . Кеңістік-уақыттың бұрмалануы тартылыс заңының бар екеніне себеп болған сияқты, организмдер арасындағы тектік қатынастар да организмдердің Линней иерархиясына орналасу себебін береді.

Ендеше, қалған сұрақ – ата-бабалар өткен мыңдаған, миллиондаған, миллиардтаған жылдар өмір сүрген кездегі ата-тегін қалай анықтаймыз. Уақытқа саяхат жасай алмайтындықтан, тірі және қазылған ағзаларды салыстырмалы зерттеулерден қарым-қатынастарды шығаруға тура келеді. Мұнда биолог Вилли Хенниг басты рөл атқарды.60 Ол ата-баба қарым-қатынастарын қалпына келтіру үшін ортақ, эмпирикалық түрде өлшенетін белгілерді пайдалану ережелерін белгіледі, осылайша әрбір топтың бір ортақ ата-тегі болуы керек. Кейінірек білетініміздей, қазіргі заманғы зерттеулерде жиі қолданылатын белгілердің бірі ген (ДНҚ) тізбегі және геномдық ұйым деректері болып табылады, дегенмен бұл жерде де ата-бабалар мен ата-бабаларды бір-бірінен ажыратқан өте ұзақ уақытқа байланысты екіұштылықтар сақталатын көптеген жағдайлар бар. қазіргі организмдер.


Табиғи емес аминқышқылдары бар фагтарды көрсету жүйесі

Мақалаларды көру - 2008 жылдың қарашасынан бастап (PDF және HTML) барлық мекемелер мен жеке тұлғалардағы толық мәтіндік мақала жүктеп алуларының ҚАРСЫ сәйкес келетін сомасы. Бұл көрсеткіштер соңғы бірнеше күндегі пайдалануды көрсету үшін жүйелі түрде жаңартылып отырады.

Дәйексөздер - бұл Crossref есептеген және күн сайын жаңартылатын осы мақалаға сілтеме жасайтын басқа мақалалардың саны. Crossref дәйексөздер саны туралы қосымша ақпаратты табыңыз.

Альтметриялық назар аудару баллы - зерттеу мақаласының желіде алған назарының сандық өлшемі. Дөңгелек белгішесін басу altmetric.com сайтында берілген мақаланың ұпайы және әлеуметтік медиа болуы туралы қосымша мәліметтері бар бетті жүктейді. Альтметриялық назар аудару баллы және ұпай қалай есептелетіні туралы қосымша ақпаратты табыңыз.


1. Кіріспе

Ақуыздар синтетикалық жасушалық желілердің маңызды құрамдас бөлігі болып табылады. Функционалды жасанды жасушаларды құрудың түпкі мақсаты бар жасушалық жолдардың синтезі тиімді реттелуі мүмкін қажетті қасиеттері бар белоктардың генерациясынан үлкен пайда әкелуі мүмкін. Қабылдаушы ағзаның эндогендік схемасынан тәуелсіз жұмыс істеуге қабілетті белоктар «бөліктер» дизайнын одан әрі дамытуды қажет етеді.

Табиғи емес аминқышқылдарына (UAA) генетикалық кодты қайта тағайындаудағы соңғы жетістіктер 12,14–16 ақуыздың «бөліктерінің» молекулалық құралдар қорабын кеңейтеді. Шын мәнінде, UAA енгізу табиғи 20 аминқышқылды құрылыс блоктарынан тұратын ақуыздармен жасау қиын немесе мүмкін емес жаңа функцияларды бере алады, мысалы, фотоиндукцияланған коммутация, 17 IR зонды белсенді 18 және тотығу-тотықсыздануға сезімтал 19 ақуыздар. Сонымен қатар, құрамында UAA бар ақуыздар жоғары тұрақтылық 20,21 және протеазаға төзімділік сияқты жақсартылған қасиеттерге әкелуі мүмкін. 22 Мұндай мүмкіндіктер синтетикалық биологиялық желілер контекстінде ортогональды ақуыздарды бейімдеу үшін пайдалы болуы мүмкін. Мұнда біз протеиндік инженерияға бағытталған және жасанды ақуыздарды жасау үшін UAA біріктіру арқылы синтетикалық биология әдістерін әлеуетті кеңейте алатын тәсілдерді талқылаймыз.


Сіз үйренетін биология дағдылары

  • Табиғат әлемін түсінуімізге негіз болатын көптеген кең ұғымдарды зерттеңіз.
  • Гипотезаны тексеру, эксперименттік жобалау, ғылыми әдебиеттерге қол жеткізу және түсіну және деректерді талдауды қоса алғанда, ғылыми әдісті енгізу тәжірибесін алу.
  • Оқуды аяқтағаннан кейін ерекше мансап мүмкіндіктері үшін жоғары бәсекеге қабілетті болу үшін қажетті білім мен практикалық дағдыларды алыңыз немесе магистратураны жалғастырыңыз.

Табиғи емес нуклеин қышқылдарының шаблондық синтезі

1980-ші жылдардың басында жасалған қатты фазалық ДНҚ синтезіне фосфорамидиттік тәсіл [38, 39] көптеген қолданбаларда синтетикалық ДНҚ-ның негізгі қолданылуына әкелді. Сол сияқты, XNA синтезіндегі жақсартулар олардың қолданылуын арттырады және алдағы онжылдықтарда жаңа қолданбалардың құлпын ашады деп күтуге болады. XNA синтезін ферментативті және ферментативті емес әдістерге бөлуге болады. Кейбір кеңінен қолданылатын XNAs (мысалы, 2′OMe, LNA, PS, 2′MOE) химиялық жолмен синтезделеді, дегенмен ең синтетикалық қол жетімді XNAs шығымдылығы шамамен 150 bp шектеледі [40]. Басқа XNA химиялары үшін сенімді қатты фазалық синтетикалық жол белгілі емес [41]. Сонымен қатар, қатты фазалық синтез синтезделетін реттілік туралы нақты білімге байланысты. Керісінше, шаблондық синтез жалпы ақпаратты тасымалдауға мүмкіндік береді және функционалды олигонуклеотидтердің эволюциясы үшін маңызды.

Ферментативті емес шаблонды синтез

Ферментативті емес шаблонды синтез дәстүрлі түрде белсендірілген нуклеотидтерді немесе қысқа олигонуклеотидті құрылыс блоктарын пайдаланады, олар шаблонда негізді бөлу әрекеттесулері арқылы өздігінен ұйымдастырылады және полимерленуге реакция жасайды. 1970 жылдары пайда болған мұндай шаблонды көшіру [42,43,44] бірнеше XNA химиясына [45,46,47,48,49,50,51,52,53], көбінесе пребиотикалық нуклеин контекстінде кеңейтілді. қышқылдық репликация. Мысалы, тотықсыздандырғыш аминацияны қолданатын PNA пентамерлерінің шаблонды репликациясына арналған жүйелер [54, 55] модель таңдау эксперименттеріне мүмкіндік беретіндей тиімді. Ұқсас стратегиялар олигонуклеотидтердің мыс-катализделген шерту байлауы [57, 58] және фосфорамидаттық байлау [59] арқылы нуклеин қышқылдарын құрастыру үшін де пайдаланылды, нәтижесінде алынған магистральдар кейбір биоүйлесімділікті көрсетті [60]. Бұл жұмыстың қызықты кеңеюінде нуклеин қышқылының шаблондары бағдарламаланған реакцияларға жақындығы бойынша химиялық нысандарды ұйымдастыру үшін де пайдаланылды [61,62,63]. Атап айтқанда, Лю тобы ДНҚ үлгісімен анықталған нақты реттілікте әртүрлі нуклеин қышқылы емес нысандарды химиялық байланыстыру үшін шаблонды синтез тәсілдерін кеңейтті [64]. Мұндай шаблондық химиялық синтездер оның құрамдас мономерлерінің полимеразалар немесе басқа нуклеин қышқылын өзгертетін ферменттер үшін субстрат ретінде қызмет ету қабілеті арқылы полимер алуан түрлілігін шектемей, барған сайын дивергентті химияларды синтездеуге және репликациялауға мүмкіндік береді.

ХНҚ-ның ферментативті байламы және модификациясы

Бірнеше ДНҚ лигазалары табиғи емес субстраттарды қабылдайтыны көрсетілді және XNA олигонуклеотидтерін синтездеу үшін жалғыз немесе XNA полимеразаларымен бірге қолданылған. Жоғарыда аталған химиялық байланыстыру стратегиялары сияқты, шаблон бойынша алдын ала ұйымдастырылған олигомерлерді ферментативті байлау белгілі локустарда бірнеше түрлі модификацияларды қоса алғанда, модификацияланған нуклеотидтерді орналастыруға мүмкіндік береді. Жақында бірнеше коммерциялық қол жетімді лигазалар XNA субстраттарын, соның ішінде 2′OMe, HNA, LNA, TNA және FANA байланыстыруды катализдей алатыны көрсетілді [41, 65]. Сонымен қатар, ұтымды дизайн және молекулалық модельдеу тәсілдері қазір бірінші XNA үлгісіндегі XNA лигазасына әкелді [66]. Лю және Хили топтары сонымен қатар гидрофобты, алифатты, хош иісті, қышқылды және қышқылды қоса алғанда, көптеген модификацияларға мүмкіндік беретін әртүрлі функционалдық ДНҚ 3- немесе 5-мерс [67, 68] модификацияланған ДНҚ-ның лигаза арқылы синтезделуімен кеңінен жұмыс жасады. осы қысқа «квазикодондар» көмегімен біріктірілетін негізгі бөліктер. SOMAmer (Slow Off-rate Modified Aptamer) таңдауларымен [22] алынған нәтижелермен келісе отырып, олар полярлық емес бөліктермен функционалдық таңдау жылдамырақ конвергенцияға және аптамерді байланыстыруды күшейтетінін анықтады [21]. Белоктарда (мысалы, галогенді қалдықтар) табылған химиялық әртүрлілікті біріктіре отырып, топ PCSK9 және интерлейкин-6 [69]-ға қарсы жоғары жақындығы бар аптамерлерді бөліп алды. Жоғарыда көрсетілген стратегиялар терапевтік потенциалы бар функционалды молекулаларды жасау үшін химиялық алмастырғыштардың кеңейтілген жиынтығымен біріктірілген нуклеин қышқылдарының бірегей қасиеттерін (яғни, кодталған синтез, эволюциялық) пайдалану парадигмасын қамтиды.

ХНҚ-ның полимеразалық синтезі

Нуклеин қышқылдарының ферментативті полимерленуі химиялық көшіру немесе синтезге қарағанда тезірек және дәлірек болып табылады және қазір фосфорамидит технологиясын алмастыру мақсатында келесі ұрпақ ДНҚ олигонуклеотидтер синтезі үшін жүргізілуде [70, 71]. Сол сияқты, ферментативті XNA синтезі XNA олигонуклеотидтерін өндіруді жеңілдетуі мүмкін. Химиялық консервативті модификациялары бар XNAs табиғи полимеразалар арқылы субстрат ретінде қабылданады, ал XNA субстраттарының кең ауқымын қабылдау үшін полимеразаларды жасау да табысқа жетті [72, 73]. Шынында да, кейбір полимеразалар жаңа субстраттарға жоғары бейімделгіштігін дәлелдеді. Термофильді В-топ полимеразалары, әсіресе олардан Пирококк және Термококк тұқымдастар, әсіресе XNA субстраттары үшін инженерияға қолайлы екенін дәлелдеді [33, 74,75,76,77,78,79,80,81]. Бұл функционалды икемділікке жоғары термотұрақтылық көмектесуі мүмкін, ол басқа жағдайда шамадан тыс тұрақсыздандыратын мутацияларға үлкен төзімділікке ықпал етеді. Дегенмен, A-семьясы [82,83,84,85,86,87,88,89,90] және Phi29 [91, 92] сияқты мезофильді полимеразалар, сондай-ақ РНҚ полимеразалар [93,94,95,96,97] ] сонымен қатар XNA субстраттарын сәтті қабылдау үшін жасалған (1-кесте). Дегенмен, XNA субстраттарындағы инженерлік полимеразалардың тиімділігі, сенімділігі және кинетикасы әдетте жергілікті ферменттер мен табиғи субстраттарға қатысты бұзылады. Жиі синтетикалық шығымдылықты арттыру үшін «мәжбүрлеу» жағдайлары қажет (мысалы, суперстохиометриялық полимераза концентрациясы немесе Mn 2+ болуы, бұл өз кезегінде сенімділікті төмендетеді) [106].

Табиғи полимеразалардың азғындығын капиталдандыру

Табиғи полимеразалардың субстраттың қатаң ерекшелігі мен дәлдігіне деген қажеттілігін ескере отырып, модификацияланған нуклеотидтерді қоса алатыны таңқаларлық. Дегенмен, нуклеотидтің кейбір позицияларында өзгерістерге оңай жол беріледі. Мысалы, пиримидиндердің C5 позициясындағы және N7-деаза-пуриндердің C7 позициясындағы модификациялар дуплекстің негізгі ойығына түседі және Уотсон-Крик базасының жұптасуына кедергі жасамайды. Сондықтан бұл позициялардағы үлкен көлемді қоспалар да полимеразалармен жақсы төзімді [22, 107,108,109,110,111,112]. Осы позициялардағы реактивті топтары бар нуклеотидтердің ферментативті синтезі (мысалы, мыс катализді шерту химиясы үшін) синтетикалық кейінгі күрделі модификацияларға мүмкіндік береді [113,114,115,116,117].

Полимераздардың пластикалық қасиеті зерттеушілерге табиғи негіздерді жақын химиялық аналогтармен көтерме ауыстыруды жүзеге асыруға да мүмкіндік берді [118, 119]. Кейбір жағдайларда синтез 1,5 кб дейін өзгертілген ПТР өнімдерін шығару үшін жеткілікті тиімді [119]. Сонымен қатар, сутегі байланысының жаңа үлгілеріне [105, 120], гидрофобтылыққа [121, 122] және пішінді толықтыруға [123,124,125] негізделген мүлдем жаңа табиғи емес негіз жұптары (UBPs) әзірленді. Бұл UBPs генетикалық кодтың сәтті кеңеюін көрсететін және жақында бұрын-соңды болмаған сегіз әріптік генетикалық алфавитте ақпаратты кодтауға қол жеткізген инженерлік және табиғи полимеразалармен қайталануы мүмкін [120].

XNA синтезі in vivo

XNAs синтезі және репликациясы in vivo XNA зерттеуіндегі табиғи емес аминқышқылдарының тұрақты кодталуы және синтетикалық биологияның «брандмауэр» үшін генетикалық ортогональдылығы сияқты мақсаттарға бағытталған маңызды шекара болып табылады. Осы мақсатта цитидинді және/немесе тимидинді бактериялық геномдардағы 5-алмастырылған пиримидин аналогтарымен толық ауыстыруға мұқият метаболикалық инженерия және эволюция арқылы қол жеткізілді [126,127,128,129].

Бір қызығы, Ромесберг пен оның әріптестері инженерлік жасай алды E. coli плазмида [130] және геномдық [131] контекстінде олардың табиғи емес NaM-TPT3 негізгі жұбын репликациялау және сақтау қабілеті бар штаммдар. Бұған қол жеткізу үшін олар нуклеозид-трифосфатты тасымалдаушыны құрастырды [132], UBP жоғалтқан тізбектерді бұзу үшін Cas9-ды шақырды және бірнеше түзетулер жасады. E. coli ДНҚ синтезі және жөндеу аппараттары. Олар бұдан әрі табиғи емес амин қышқылдарын арнайы кодтау үшін UBP-тің аударма аппаратымен үйлесімділігін көрсетті [133, 134]. Ауыстырылған геномдары немесе UBP тарату мүмкіндігі бар бұдан әрі жартылай синтетикалық организмдер осы ерте табыстарға жетуі мүмкін [135, 136].

XNA полимераза инженериясы үшін бағытталған эволюция

Негізгі модификациялар және тіпті мүлдем жаңа жұптар табиғи полимеразалармен әртүрлі дәрежеде төзімді болғанымен, қант пен омыртқаның модификациялары әдетте, әсіресе толық алмастыру кезінде қиынырақ болады. Осындай табиғи емес субстраттармен белсенділікті жақсарту үшін құрылымдық түсініктерге немесе есептеу талдауына негізделген ұтымды инженериядан скрининг пен бағытталған эволюцияға дейінгі полимеразды инженерлік тәсілдер жиі қолданылады. Олардың ішінде эмульсияға негізделген әдістер мен фагтарды көрсету әсіресе пайдалы болды [137, 138].

Бұл салада бағытталған эволюцияның бірқатар стратегиялары қолданылды. Бөлімшеленген өзін-өзі репликация (CSR) [139,140,141] полимераздарды ПТР эмульсия бөлімінде өз генін күшейтуге шақырады. Белсенді нұсқаларды қарапайым бөлуге қарағанда жоғары белсенді клондарды экспоненциалды байыту CSR күшті әдіс етеді. Дегенмен, ол полимераздың өнімділігіне қатаң талаптар қояды, олар қысқа патч CSR (spCSR) [85] кезінде біршама жеңілдетілген, мұнда күшейту полимераз генінің қысқа бөлігімен ғана шектеледі. Кірістірілген CSR CSR күшейту қадамы кезінде осы мүмкіндіктерге ие кірістірілген праймерлерді пайдалану арқылы полимераз генінің өзінде жоқ тізбектерді немесе мүмкіндіктерді таңдауға мүмкіндік береді (мысалы, жаңа базалық жұптар, XNA үлгілерінің кері транскрипциясы) [79, 86]. Бөлімшеленген серіктестік репликация (CPR) деп аталатын қосымша кеңейтімді серіктес генінің жарамдылығы арқылы таңдалатын ПТР реакциясын шектеу арқылы нуклеин қышқылының полимерленуінен басқа ферментативті белсенділікті таңдау үшін пайдалануға болады [86, 142]. Жақында КСЖ изотермиялық күшейту реакциялары (iCSR) үшін де жоғары температурада [143] және термотұрақты емес ферменттердің [91] эволюциясы үшін төмен температурада да бейімделген. Бөлімшеленген өзін-өзі белгілеу (CST) [144] әлдеқайда қиын субстраттарды таңдауға мүмкіндік береді немесе шарттарды таңдау кодтау плазмидасымен шаблонды праймер кеңейтіміне негізделген. Биотинилденген праймер және жеткілікті праймер ұзартуымен «ұстап алынған» кез келген плазмидалар стрептавидин моншақтарына бөлінеді. CST бірқатар XNAs [78] үшін полимеразалар берді, ең соңғы dxNA үшін [145]. Жаппай эмульсиялау әдістерінен айырмашылығы, микрофлюидті құрылғылар біртекті эмульсия тамшыларын жасау үшін пайдаланылды, бұл қадамдық таңдау кезінде маңызды шағын қадамдық жақсартуларды дәл ажырату мүмкіндігін арттырады [146, 147]. Басқа бағытталған эволюция стратегиясы фагтық дисплей болып табылады, оның көмегімен фаг бөлшектерінде көрсетілетін полимеразалар бөлінетін (мысалы, биотинделген) нуклеотидтермен праймерді ұзартуға шақырылады [80, 89, 148]. Полимераза эволюциясы үшін фагтық дисплейді жақында қолдануда Чен және т.б. 2′OMe РНҚ [88] синтездеуге және кері транскрипциялауға қабілетті бірнеше Taq нұсқаларын анықтады, оның биологиялық тұрақтылығы мен нуклеазаға төзімділігі жоғары болғандықтан терапевтика үшін ерекше қызығушылық тудыратын XNA.

XNA полимеразаларының рационалды инженериясы: құрылымдық түсініктер

Полимеразалар каталитикалық цикл кезінде түсетін нуклеотидтрифосфатпен және праймер тізбегімен көптеген негізгі байланыстар жасайды [149]. Модификацияланған субстраттары бар кешендегі полимераздардың құрылымдары XNA полимеразаларын ұтымды инженерияға және ретроспективті түсінуге көмектеседі. Жақында Кропп және т.б. катализ цикліндегі алты дәйекті позицияның [150] әрқайсысында C5-модифицирленген цитидинмен KlenTaq полимеразасының шешілген үштік құрылымдары, полимеразаның белсенді учаскесі арқылы модификацияланған субстраттың қозғалысын қайталап және модификацияланған нуклеотидте де икемділіктің таңқаларлық деңгейін көрсетті. және модификацияны орналастыру үшін өзара әрекеттесетін полимераза қалдықтары.

XNA полимерленуі туралы қосымша құрылымдық түсінік туралы Сингх және т.б. [151] екілік алдын ала инкорпорациядағы инженерлік KlenTaq құрылымдарымен және dZ:dP табиғи емес негіз жұбы бар үштік постинкорпорация кешенімен. Мутацияға ұшыраған аминқышқылдарының ешқайсысы праймермен, шаблонмен немесе кіріс dZTP-мен тікелей байланыста болмаса да, құрылым икемділікті жоғарылататынын, әсіресе бас бармақ субдоменінде және саусақ қосалқы доменіндегі жабылу бұрышының жоғарылауы праймердің табиғи емес негізмен ұзаруын жеңілдететінін көрсетеді. жұп.

Чим және т.б. жуырда гипертермофильді В-семьясының полимеразасының үштік құрылымдары, инженерлік KOD мутанты, полимерленетін ТНҚ [152] туралы хабарлады. Полимеразды инженерияда В-семьясының гипертермофилдерінің кең таралғанын ескере отырып, апо, екілік және үштік полимеразалық кешендердің құрылымдары осы саладағы әрі қарай жұмыс істеу үшін гипотезаларды әзірлеуде пайдалы болады. Кейіннен жарияланған KOD және 9°N үштік құрылымдары ДНҚ праймері мен үлгісі және кіріс dNTP [149, 153] инженерияға гипертермофильді архейлік В-семьясының полимеразаларының бейімділігі үшін ықтимал түсініктемелерді ұсынады: саусақ арасындағы әдеттен тыс кең және оң зарядталған арна. және thumb қосалқы домендері үлгімен күшті байланыстыруды және жоғары өңдеуді сақтай отырып, субстрат модификациялары үшін кеңістікті қамтамасыз етуі мүмкін. Сонымен қатар, праймер үлгісінің дуплексі А-топ полимеразаларының белсенді орнында А-пішінді қабылдайтын болса, ол KOD-да В-пішінін қабылдайды, бұл В-формасының дуплексінің кеңірек негізгі ойығында нуклеотидтік модификациялардың орналасуына ықпал етуі мүмкін.

XNA полимеразаларының рационалды инженериясы: субстраттар мен полимеразалар арасындағы мутацияларды трансляциялау

XNA субстраттары мен полимеразалар арқылы тасымалданатын мутациялардың көптеген мысалдары бар. Жақында жасалған есепте [154] 2′ модификацияланған XNA-ны жақсырақ қосу үшін бұрын сипатталған Taq мутантының инженериясын егжей-тегжейлі сипаттайды. Түрлі 2′ модификацияланған нуклеотидтердің қосылуы туралы кинетикалық деректерден жылдамдықты шектейтін қадам модификацияланған праймер тізбегін тану болуы мүмкін деген гипотеза негізінде әдебиеттен сәйкес мутациялар таңдалды. Бірнеше мутанттар 2′F және 2′OMe синтезінің жоғарылауын және/немесе 2′OMe РНҚ кері транскрипциясын көрсетті. Басқа жағдайда есептеу талдауы, эволюциялық консервация және әдебиет прецеденті арқылы таңдалған сегіз «ерекшелікті анықтайтын қалдық» бойынша әртараптандыру РНҚ және ТНҚ үшін жақсартылған полимеразаларды берді [75]. Сонымен қатар, әртүрлі гомологтық В-семьясының полимеразалары контекстінде жоғарғы мутация жиындарын сынау олардың жалпы пайдалылығын дәлелдеді, сонымен қатар олар жақсы жұмыс істейтін құрылымдық контекстті ашты. Сол сияқты, барған сайын алуан түрлі XNA-лардың полимераза синтезіне ТНҚ қантын полимеразбен үйлесімді деп белгілі негіздік модификациялармен біріктіру арқылы ТНҚ полимеразасымен қол жеткізілді [31, 32]. Консервацияланған қалдықтардың мутациясы өте зиянды деп есептелсе де, осы және басқа жұмыстар арқылы мұндай мутациялар табиғи емес субстраттармен белсенділікке мүмкіндік беретін негізгі рөл атқара алатыны барған сайын айқын бола бастады [75, 155].

Лю және т.б. Жақында жаңадан сипатталған XNA, tPhoNA синтездеу үшін полимеразаның инженериясы қант пен омыртқаның модификациялары бар [33]. Бір қызығы, полимеразды инженерия стратегиясы тек басқа XNA субстраттары үшін синтезге әсер ететін белгілі позициялардағы мутацияларды дәйекті енгізу және бағалаудан тұрды. Олардың жетістігі полимеразалық инженерия саласындағы жинақталған білім базасының және субстраттың кеңейтілген спектрін беру үшін аздаған арнайы негізгі мутациялардың ерекше қабілетінің дәлелі болып табылады.

РНҚ полимеразалары XNA синтездеу үшін де жасалған. T7 RNAP құрамында Ds-Pa UPB бар ДНҚ-дан мазмұнды кеңейтілген РНҚ, сонымен қатар одан әрі модификацияланған Па негіздері [103] транскрипциялай алатыны көрсетілді. Бұрын анықталған мутациялардың шағын экраны арқылы Кимото және т.б. 2′-F урацил мен цитидин трифосфаттарын қамтитын және қиын дәйектілік контексттерінде Па нуклеотидтері мен олардың аналогтарының жақсартылған қосылуын көрсететін T7 RNAP мутантын анықтады [93]. Бір таңқаларлығы, аптамер мен рибозим таңдауы үшін химиялық әртүрлілікті кеңейтуге арналған Па нуклеотидінің бірнеше көлемді модификациялары бастапқы Па трифосфаттарына қарағанда жақсы субстраттар болып көрінеді. Сол сияқты, бұрын HNA синтездеу үшін дамыған Tgo полимераза мутанты жақында уридин негізінде әртүрлі хош иісті модификациялары бар HNA нуклеотидтерін біріктіретіні көрсетілді [35]. Мұнда да кейбір көлемді базалық модификациялар жоғары біріктіруді көрсетті.

XNA-ның кері транскрипциясы

XNA-ны кері транскрипциялауға қабілетті ферменттерді анықтау генетикалық материалдар ретінде осы дивергентті химияның әлеуетін көрсетеді және in vitro іріктеу үшін өте маңызды [156]. Кейбір XNA табиғи полимеразалармен кері транскрипциялануы мүмкін (мысалы, Bst полимераза арқылы TNA және FANA [157,158,159]). Балама түрде инженерлік тәсілдер қабылдануы керек [79, 88]. Мутациялардың аз саны Tgo полимераза бірнеше ХНҚ-ны ДНҚ-ға кері транскрипциялай алатын жалпы кеңейтілген субстрат спектрі бар кері транскриптазаны берді [29, 78].

XNA және XNA полимеразаларды талдау

XNA-мен жұмыс істеудегі қиындықтардың бірі - олар нуклеин қышқылымен манипуляциялаудың немесе талдаудың дәстүрлі әдістерімен, мысалы, рестриктеуші ферменттер және секвенирлеу технологияларымен үйлеспейді. Осылайша, XNA және XNA полимеразаларды дамытудың маңызды параллельді әрекеті оларды талдау үшін құралдарды жасау болып табылады. Мысалы, сипатталған көптеген XNA полимеразалары үшін сенімділік егжей-тегжейлі бағаланбаған. Адалдықты анықтаудың соңғы әдісі салыстырмалы түрде аз және табиғи РНҚ модификациялары полимераз қателерінің жылдамдығын айтарлықтай арттыра алатынын анықтады [160]. Терең реттілік сонымен қатар қате профильдерін және магистральдық модификациялары бар үлгілердің полимеразды оқуын зерттеу үшін пайдаланылды [161] және кейбір жиі қолданылатын изотериялық модификациялар, мысалы, фосфоротиоттар, көшіруде елеулі қателіктер тудыратынын анықтады. Бұл сенімділік деректері ферменттік XNA синтезіндегі маңызды шектеуді болжайды, оны өріс алға жылжыған сайын шешу қажет болады. Екінші жағынан, полимераздардың азғындық әрекеті модификациялардағы қате «қолтаңбалар» арқылы эпигенетикалық ДНҚ және РНҚ модификацияларының болуын оқу және жазу үшін қолданылды [162,163,164,165,166,167,168,169,170]. Сонымен қатар, жақында XNA тікелей секвенирлеуінің бірінші данасы туралы хабарланды, FANA салыстырмалы түрде қысқа оқу ұзақтығымен болса да, нанопора технологиясын қолдану арқылы реттелген [171].

Әсіресе құралдардың жетіспеушілігімен шектелген XNA L-DNA болып табылады. Мұндай «айна кескіні» ДНҚ химиялық деңгейде ДНҚ-ға бірдей қасиеттерді сақтай отырып, макромолекула масштабындағы ерекшеліктерде де, өзара әрекеттесулерде де толық ортогоналдылықты қамтамасыз етеді. Осылайша, L-ДНҚ-ның ферментативті синтезі үшін D-амин қышқылдарынан жасалған айналы бейнелі полимеразалар қажет. Чжу мен оның әріптестері алдымен белгілі ең кішкентай полимеразаның D-формасын жасады, африкалық шошқа обасы вирусының полимеразасы X және оны L-ДНҚ синтездеу үшін қолданды, бұл полимеразаның D-нуклеотид трифосфаттарынан ешқандай кроссовер тежелусіз қатаң энантио-спецификалық екенін көрсетті. 102]. Кейінірек топ L-ДНҚ өнімін ПТР күшейтуге мүмкіндік беретін D-амин қышқылдарымен үлкенірек термотұрақты Dpo4 полимеразасының мутантының синтезі туралы хабарлады [99, 100]. Клуссман және оның әріптестері гендік ұзындықтағы L-ДНҚ тізбегін құрастыру үшін пайдаланылған D-Dpo4 мутантының [101] синтезі туралы хабарлады. Айна кескінінің лигазасы да хабарланды [172]. Айна бейнесі нуклеин қышқылдары терапевтика үшін үлкен қызығушылық тудырады және зерттеулер мен клиникалық дамуда белсенді түрде жүргізілуде [173]. Дегенмен, оларды пайдалану D-полимеразаларды синтездеудің қиын процесімен және L-ДНҚ-ның дәстүрлі нуклеин қышқылымен манипуляциялау құралдарымен үйлеспеуімен шектеледі.


Тірі жүйелердегі химия

Күрделі жасушалық процестерді бөлу биомолекулаларды өздерінің мекендейтін орталарында жұмыс істеуін қадағалау мүмкіндігін талап етеді. GFP сияқты генетикалық кодталған тегтер дискретті ақуыздарды бақылау үшін кеңінен пайдаланылғанымен, олар белок құрылымына елеулі бұзылулар тудыруы мүмкін және гликандар, липидтер, нуклеин қышқылдары және қайталама метаболиттер сияқты биомолекулалардың басқа сыныптарына тікелей таралмайды. Соңғы жылдары химиялық биология қауымдастығынан биомолекулаларды белгілеудің балама құралы пайда болды - биоортогональды химиялық репортер. Прототиптік экспериментте жасушаның жеке биосинтетикалық механизмін пайдалана отырып, мақсатты биомолекулаға көбінесе бір функционалды топ сияқты шағын бірегей химиялық мотив енгізіледі. Содан кейін химиялық репортер экзогенді түрде жеткізілетін зондпен жоғары селективті түрде ковалентті түрлендіріледі. Бұл шолу биоортогональды химиялық репортерлер мен реакциялардың дамуын және олардың тірі жүйелерде қолданылуын көрсетеді.


3.2: Табиғи және табиғи емес топтар - Биология

Антропология

Бұрынғы және бүгінгі адамдар мен мәдениеттер

Археология

Ежелгі дәуірдегі адамдар мен артефактілер

Астрономия

Ғалам және ондағы барлық нәрсе

Биоәртүрлілік

Жер бетіндегі тіршіліктің алуан түрлілігі

Ми

Бас сүйектеріміздің ішіндегі орган

Климаттық өзгеріс

Жаһандық температураның ұзақ мерзімді өзгерістері

Жер

Біз үй деп атайтын динамикалық планета

Генетика

Гендер ұрпаққа қалай беріледі

Теңіз биологиясы

Микробиология

Бактериялар, вирустар және басқа микроорганизмдер

Палеонтология

Динозаврлар және ертеде өмір сүрген басқа заттар

Физика

Материя және оның кеңістік пен уақыт арқылы қозғалысы

Су

Жердегі тіршілікті мүмкін ететін сұйықтық

Зоология

Жәндіктерден сүтқоректілерге дейінгі барлық жануарлар

Күннің ОЛология картасы: Сіз білдіңіз бе?

Коалалар аю емес. Олар марсупиалдар және кенгурулармен жақынырақ.

Кейбір метеориттер айдың кішкентай бөліктері болып табылады.

Егер Антарктиданы жауып тұрған мұздар еріп кетсе, жаһандық теңіз деңгейін 70 метрге (230 фут) дерлік көтереді.

Жарқанаттар – нағыз ұша алатын жалғыз сүтқоректілер.

Шыбындар мүлде шыбын емес. Олар қоңыздар!

Антарктида – мұхитпен қоршалған материк. Арктика керісінше, материктермен қоршалған мұхит кеңістігі.

"Атқан жұлдыздар" шын мәнінде метеорлар.

Көптеген сауроподтар ескі тістері ескірген сайын айына бір рет жаңа тістерді өсірді.

Кейбір метеориттер күн жүйесі сияқты ескі.

Құрсақтағы алғашқы бес айда минут сайын жарты миллион нейрон пайда болады.

Бірдей егіздер бірдей гендерге ие, бірақ саусақ іздері ерекше.


Жасанды сұрыптау дегеніміз не

Жасанды сұрыптау – жануарлар мен өсімдіктерді қажетті және тұқым қуалайтын мінездері бар ұрпақтар алу үшін іріктеп өсіру. Жасанды сұрыптау – адам қолымен қалаған кейіпкерлерді іріктеу процесі және ол негізінен мал шаруашылығында және жақсартылған дақылдарда қолданылады. Фермерлер жануарларда да, өсімдіктерде де өздері қалаған тұқым қуалайтын белгілерді сақтау үшін Дарвин генетиканы ашқанға дейін жасанды өсіруді пайдаланды. Ірі қара малда сүтті көбірек өндіру мүмкіндігі, арық бұлшықеттердің жылдам өсуі, Саванна мысықтары сияқты экзотикалық үй жануарлары және Чиуауа сияқты кішкентай иттер жасанды өсіру арқылы шығарылады. Бельгиялық сиыр бұлшық еттерінің жылдам өсуіне байланысты селективті өсіру арқылы ұсталады.

3-сурет: Бельгиялық сиыр

Сонымен қатар, жасанды сұрыптау өсімдіктердің сан алуан түрлілігін өндіруде қолданылады. Жүгері, бидай және соя штаммдары ауыл шаруашылығында пайдалы қасиеттерді жасанды түрде іріктеу арқылы жасалады. Broccoli, Brussels sprouts, cabbage, cauliflower, collards, and kale are produced by the careful selective breeding of wild mustard. Roses and orchids are also cultivated by selective breeding. Artificial selection can also produce various colors in carrot roots.

Figure 4: Carrots with multiple colored roots


2. Kin Selection and Inclusive Fitness

The basic idea of kin selection is simple. Imagine a gene which causes its bearer to behave altruistically towards other organisms, e.g. by sharing food with them. Organisms without the gene are selfish&mdashthey keep all their food for themselves, and sometimes get handouts from the altruists. Clearly the altruists will be at a fitness disadvantage, so we should expect the altruistic gene to be eliminated from the population. However, suppose that altruists are discriminating in who they share food with. They do not share with just anybody, but only with their relatives. This immediately changes things. For relatives are genetically similar&mdashthey share genes with one another. So when an organism carrying the altruistic gene shares his food, there is a certain probability that the recipients of the food will also carry copies of that gene. (How probable depends on how closely related they are.) This means that the altruistic gene can in principle spread by natural selection. The gene causes an organism to behave in a way which reduces its own fitness but boosts the fitness of its relatives&mdashwho have a greater than average chance of carrying the gene themselves. So the overall effect of the behaviour may be to increase the number of copies of the altruistic gene found in the next generation, and thus the incidence of the altruistic behaviour itself.

Though this argument was hinted at by Haldane in the 1930s, and to a lesser extent by Darwin in his discussion of sterile insect castes in Түрлердің шығу тегі, it was first made explicit by William Hamilton (1964) in a pair of seminal papers. Hamilton demonstrated rigorously that an altruistic gene will be favoured by natural selection when a certain condition, known as Hamilton's rule, is satisfied. In its simplest version, the rule states that б > в/r, қайда в is the cost incurred by the altruist (the donor), b is the benefit received by the recipients of the altruism, and r is the co-efficient of relationship between donor and recipient. The costs and benefits are measured in terms of reproductive fitness. The co-efficient of relationship depends on the genealogical relation between donor and recipient&mdashit is defined as the probability that donor and recipient share genes at a given locus that are &lsquoidentical by descent&rsquo. (Two genes are identical by descent if they are copies of a single gene in a shared ancestor.) In a sexually reproducing diploid species, the value of r for full siblings is ½, for parents and offspring ½, for grandparents and grandoffspring ¼, for full cousins 1/8, and so-on. The higher the value of r, the greater the probability that the recipient of the altruistic behaviour will also possess the gene for altruism. So what Hamilton's rule tells us is that a gene for altruism can spread by natural selection, so long as the cost incurred by the altruist is offset by a sufficient amount of benefit to sufficiently closed related relatives. The proof of Hamilton's rule relies on certain non-trivial assumptions see Frank 1998, Grafen 1985, 2006, Queller 1992a, 1992b, Boyd and McIlreath 2006 and Birch forthcoming for details.

Though Hamilton himself did not use the term, his idea quickly became known as &lsquokin selection&rsquo, for obvious reasons. Kin selection theory predicts that animals are more likely to behave altruistically towards their relatives than towards unrelated members of their species. Moreover, it predicts that the дәрежесі of altruism will be greater, the closer the relationship. In the years since Hamilton's theory was devised, these predictions have been amply confirmed by empirical work. For example, in various bird species, it has been found that &lsquohelper&rsquo birds are much more likely to help relatives raise their young, than they are to help unrelated breeding pairs. Similarly, studies of Japanese macaques have shown that altruistic actions, such as defending others from attack, tend to be preferentially directed towards close kin. In most social insect species, a peculiarity of the genetic system known as &lsquohaplodiploidy&rsquo means that females on average share more genes with their sisters than with their own offspring. So a female may well be able to get more genes into the next generation by helping the queen reproduce, hence increasing the number of sisters she will have, rather than by having offspring of her own. Kin selection theory therefore provides a neat explanation of how sterility in the social insects may have evolved by Darwinian means. (Note, however, that the precise significance of haplodiploidy for the evolution of worker sterility is a controversial question see Maynard Smith and Szathmary 1995 ch.16, Gardner, Alpedrinha and West 2012.)

Kin selection theory is often presented as a triumph of the &lsquogene's-eye view of evolution&rsquo, which sees organic evolution as the result of competition among genes for increased representation in the gene-pool, and individual organisms as mere &lsquovehicles&rsquo that genes have constructed to aid their propagation (Dawkins 1976, 1982). The gene's eye-view is certainly the easiest way of understanding kin selection, and was employed by Hamilton himself in his 1964 papers. Altruism seems anomalous from the individual organism's point of view, but from the gene's point of view it makes good sense. A gene wants to maximize the number of copies of itself that are found in the next generation one way of doing that is to cause its host organism to behave altruistically towards other bearers of the gene, so long as the costs and benefits satisfy the Hamilton inequality. But interestingly, Hamilton showed that kin selection can also be understood from the organism's point of view. Though an altruistic behaviour which spreads by kin selection reduces the organism's personal fitness (by definition), it increases what Hamilton called the organism's қоса алғанда fitness. An organism's inclusive fitness is defined as its personal fitness, plus the sum of its weighted effects on the fitness of every other organism in the population, the weights determined by the coefficient of relationship r. Given this definition, natural selection will act to maximise the inclusive fitness of individuals in the population (Grafen 2006). Instead of thinking in terms of selfish genes trying to maximize their future representation in the gene-pool, we can think in terms of organisms trying to maximize their inclusive fitness. Most people find the &lsquogene's eye&rsquo approach to kin selection heuristically simpler than the inclusive fitness approach, but mathematically they are in fact equivalent (Michod 1982, Frank 1998, Boyd and McIlreath 2006, Grafen 2006).

Contrary to what is sometimes thought, kin selection does not require that animals must have the ability to discriminate relatives from non-relatives, less still to calculate coefficients of relationship. Many animals can in fact recognize their kin, often by smell, but kin selection can operate in the absence of such an ability. Hamilton's inequality can be satisfied so long as an animal behaves altruistically towards other animals that are Ақиқатында its relatives. The animal мүмкін achieve this by having the ability to tell relatives from non-relatives, but this is not the only possibility. An alternative is to use some proximal indicator of kinship. For example, if an animal behaves altruistically towards those in its immediate vicinity, then the recipients of the altruism are likely to be relatives, given that relatives tend to live near each other. No ability to recognize kin is presupposed. Cuckoos exploit precisely this fact, free-riding on the innate tendency of birds to care for the young in their nests.

Another popular misconception is that kin selection theory is committed to &lsquogenetic determinism&rsquo, the idea that genes rigidly determine or control behaviour. Though some sociobiologists have made incautious remarks to this effect, evolutionary theories of behaviour, including kin selection, are not committed to it. So long as the behaviours in question have a genetical құрамдас, i.e. are influenced to some extent by one or more genetic factor, then the theories can apply. When Hamilton (1964) talks about a gene which &lsquocauses&rsquo altruism, this is really shorthand for a gene which increases the probability that its bearer will behave altruistically, to some degree. This is much weaker than saying that the behaviour is genetically &lsquodetermined&rsquo, and is quite compatible with the existence of strong environmental influences on the behaviour's expression. Kin selection theory does not deny the truism that all traits are affected by both genes and environment. Nor does it deny that many interesting animal behaviours are transmitted through non-genetical means, such as imitation and social learning (Avital and Jablonka 2000).

The importance of kinship for the evolution of altruism is very widely accepted today, on both theoretical and empirical grounds. However, kinship is really only a way of ensuring that altruists and recipients both carry copies of the altruistic gene, which is the fundamental requirement. If altruism is to evolve, it must be the case that the recipients of altruistic actions have a greater than average probability of being altruists themselves. Kin-directed altruism is the most obvious way of satisfying this condition, but there are other possibilities too (Hamilton 1975, Sober and Wilson 1998, Bowles and Gintis 2011, Gardner and West 2011). For example, if the gene that causes altruism also causes animals to favour a particular feeding ground (for whatever reason), then the required correlation between donor and recipient may be generated. It is this correlation, however brought about, that is necessary for altruism to evolve. This point was noted by Hamilton himself in the 1970s: he stressed that the coefficient of relationship of his 1964 papers should really be replaced with a more general correlation coefficient, which reflects the probability that altruist and recipient share genes, whether because of kinship or not (Hamilton 1970, 1972, 1975). This point is theoretically important, and has not always been recognized but in practice, kinship remains the most important source of statistical associations between altruists and recipients (Maynard Smith 1998, Okasha 2002, West т.б. 2007).

2.1 A Simple Illustration: the Prisoner's dilemma

The fact that correlation between donor and recipient is the key to the evolution of altruism can be illustrated via a simple &lsquoone shot&rsquo Prisoner's dilemma game. Consider a large population of organisms who engage in a social interaction in pairs the interaction affects their biological fitness. Organisms are of two types: selfish (S) and altruistic (A). The latter engage in pro-social behaviour, thus benefiting their partner but at a cost to themselves the former do not. So in a mixed (S,A) pair, the selfish organism does better&mdashhe benefits from his partner's altruism without incurring any cost. However, (A,A) pairs do better than (S,S) pairs&mdashfor the former work as a co-operative unit, while the latter do not. The interaction thus has the form of a one-shot Prisoner's dilemma, familiar from game theory. Illustrative payoff values to each &lsquoplayer&rsquo, i.e., each partner in the interaction, measured in units of biological fitness, are shown in the matrix below.

Player 2
Altruist Selfish
Player 1 Altruist 11,11 0,20
Selfish 20,0 5,5
Payoffs for (Player 1, Player 2) in units of reproductive fitness

The question we are interested in is: which type will be favoured by selection? To make the analysis tractable, we make two simplifying assumptions: that reproduction is asexual, and that type is perfectly inherited, i.e., selfish (altruistic) organisms give rise to selfish (altruistic) offspring. Modulo these assumptions, the evolutionary dynamics can be determined very easily, simply by seeing whether the С немесе А type has higher fitness, in the overall population. The fitness of the С түрі, В(С), is the weighted average of the payoff to an С when partnered with an С and the payoff to an С when partnered with an А, where the weights are determined by the probability of having the partner in question. Сондықтан,

(The conditional probabilities in the above expression should be read as the probability of having a selfish (altruistic) partner, given that one is selfish oneself.)

Similarly, the fitness of the А type is:

From these expressions for the fitnesses of the two types of organism, we can immediately deduce that the altruistic type will only be favoured by selection if there is a statistical correlation between partners, i.e., if altruists have greater than random chance of being paired with other altruists, and similarly for selfish types. For suppose there is no such correlation&mdashas would be the case if the pairs were formed by random sampling from the population. Then, the probability of having a selfish partner would be the same for both С және А types, i.e., P(С partner/С) = P(С partner/А). Similarly, P(А partner/С) = P(А partner/А). From these probabilistic equalities, it follows immediately that В(С) is greater than В(А), as can be seen from the expressions for В(С) және В(А) above so the selfish type will be favoured by natural selection, and will increase in frequency every generation until all the altruists are eliminated from the population. Therefore, in the absence of correlation between partners, selfishness must win out (cf. Skyrms 1996). This confirms the point noted in section 2&mdashthat altruism can only evolve if there is a statistical tendency for the beneficiaries of altruistic actions to be altruists themselves.

If the correlation between partners is sufficiently strong, in this simple model, then it is possible for the condition В(А) > В(С) to be satisfied, and thus for altruism to evolve. The easiest way to see this is to suppose that the correlation is perfect, i.e., selfish types are always paired with other selfish types, and ditto for altruists, so P(С partner/С) = P(А partner/А) = 1. This assumption implies that В(А)=11 and В(С)=5, so altruism evolves. With intermediate degrees of correlation, it is also possible for the condition В(С) > В(А) to be satisfied, given the particular choice of payoff values in the model above.

This simple model also highlights the point made previously, that donor-recipient correlation, rather than genetic relatedness, is the key to the evolution of altruism. What is needed for altruism to evolve, in the model above, is for the probability of having a partner of the same type as oneself to be sufficiently larger than the probability of having a partner of opposite type this ensures that the recipients of altruism have a greater than random chance of being fellow altruists, i.e., donor-recipient correlation. Whether this correlation arises because partners tend to be relatives, or because altruists are able to seek out other altruists and choose them as partners, or for some other reason, makes no difference to the evolutionary dynamics, at least in this simple example.


3.2: Natural and un-natural groups - Biology

Graduate School of Pharmaceutical Science, Tokushima University

Graduate School of Pharmaceutical Science, Tokushima University

2018 Volume 66 Issue 2 Pages 132-138

  • Published: February 01, 2018 Received: August 29, 2017 Released on J-STAGE: February 01, 2018 Accepted: - Advance online publication: - Revised: -

(compatible with EndNote, Reference Manager, ProCite, RefWorks)

(compatible with BibDesk, LaTeX)

In this review, we have summarized the research effort into the development of unnatural base pairs beyond standard Watson–Crick (WC) base pairs for synthetic biology. Prior to introducing our research results, we present investigations by four outstanding groups in the field. Their research results demonstrate the importance of shape complementarity and stacking ability as well as hydrogen-bonding (H-bonding) patterns for unnatural base pairs. On the basis of this research background, we developed unnatural base pairs consisting of imidazo[5′,4′:4.5]pyrido[2,3-г]pyrimidines and 1,8-naphthyridines, яғни, Im : Na pairs. Since Im bases are recognized as ring-expanded purines and Na bases are recognized as ring-expanded pyrimidines, Im : Na pairs are expected to satisfy the criteria of shape complementarity and enhanced stacking ability. In addition, these pairs have four non-canonical H-bonds. Because of these preferable properties, ImN N : NaO O , one of the Im : Na pairs, is recognized as a complementary base pair in not only single nucleotide insertion, but also the PCR.

Recently, work by the Human Genome Project-Write, which focuses on synthesizing human genomes, has started. 1) Rewriting entire human genomes will deepen our understanding of the genetic code and have an impact on human health. In this manner, synthetic biology is a bottom-up-type research field that deals with the preparation of materials that comprise life systems. As only two base pairs have been selected during the evolution of life, яғни, adenine (A) : thymine (T) and guanine (G) : cytosine (C) pairs, these represent ideal genetic polymers. The specific formation of hydrogen bonds (H-bonds) in the A : T pair (two H-bonds) and G : C pair (three H-bonds) is the most fundamental rule of genetic information. In 1962, with surprising foresight, Rich proposed the possibility of an extra artificial base pair, яғни, isoguanine (isoG, 6-amino-2-oxopurine) and isocytosine (isoC, 2-amino-4-oxopurine), representing fifth and sixth DNA nucleobases. 2) The artificially designed isoG : isoC pair has three H-bonds with the specific proton donor (D) and proton acceptor (A) geometry [DDA : AAD], which is different from those in the A : T pair ([DA : AD]) and the G : C pair ([ADD : DAA]) (Fig. 1). If an extra base pair can function selectively in replication, transcription, and translation alongside natural Watson–Crick (WC) base pairs, it could potentially allow expansion of the genetic code. Thus, the creation of unnatural base pairs is a challenging and ideal research theme in synthetic biology. Herein, research into the development of unnatural base pairs and their applications are described.

Prior to presenting our unnatural base pair studies, the work of four famous and pioneering groups focusing on unnatural base pairs is introduced.

2.1. Unnatural Base Pairs with Non-standard H-Bonding Geometries Benner’s Group

In 1989, Benner and colleagues synthesized isoG және isoC nucleosides and their triphosphates with the goal of expanding the genetic alphabet 3) (Fig. 1). The isoG : isoC pair was recognized as a complementary base pair by polymerases both in in vitro replication and transcription systems. 4) They also designed other unnatural base pairs with different H-bonding patterns, such as the X : κ жұп. 5) Additionally, they succeeded in incorporating the unnatural amino acid 3-iodotyrosine into a peptide by using a pair of 54-mer mRNA comprising isoC and tRNA with an isoGUC anticodon in in vitro translation systems. 6) These were the first studies to succeed in artificially rebuilding the central dogma using unnatural base pairs, indicating that the alteration of H-bonding geometries in base pairs is a promising strategy for creating a new unnatural base pairs. However, the selectivity of the isoG : isoC pair in enzymatic replication was unsatisfactory. Бұл себебі isoG has a problem with tautomerism, in that the enol form of isoG has a [DAD] H-bonding pattern that is complementary to that of T. 4) In 2005, to address this drawback of isoG, they replaced natural T with 2-thioT (T s ). 7) Because of the bulkiness and H-bonding properties (weak proton acceptability) of the thione, T s is less likely to mispair with the tautomer of isoG than natural T. Fidelity per doubling of the isoG : isoC pair along with the A : T s pair in the PCR was improved by around 98%, although that with natural A : T was 93%. 7) However, when using an unnatural base pair with 98% replication fidelity, the retention of the unnatural base pair in its amplified DNA fragment after a 20-cycle PCR is decreased to 67% (яғни, 0.98 20 =ca. 0.67). Because the error rate for natural WC pairing in replication is ca. 10 −6 errors/bp, highly exclusive selectivity of unnatural base pairs is required. Thus, they also created another unnatural base pair comprising 2-aminoimidazo[1,2-а]-1,3,5-triazin-4(8Х)-one (П) and 6-amino-5-nitro-2(1Х)-pyridone (З). 8) The П : З pair, which has [AAD : DDA] H-bonding geometry, exhibits up to 99.8% fidelity per doubling without using the A : T s pair because, unlike isoG, З does not tautomerize. 9) Recently, they applied the six-letter genetic system with the П : З pair to the cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) system and succeeded in obtaining highly active aptamers against HepG2 liver cancer cells. 10)

2.2. Non-hydrogen-Bonded Unnatural Base Pairs Kool’s Group

During the same decade as Benner’s pioneering works, Kool т.б. have explored the possibility of non-H-bonded unnatural base pairs. In 1998, they created an unnatural base pair comprising 4-methylbenzimidazole (З) 11) and 2,4-difluorotoluene (Ф) as steric isosteres of the natural A : T pair 12,13) (Fig. 2A). а in vitro replication system, З және Ф were equally replaced with natural A and T but not G and C, demonstrating the importance of shape complementary and stacking interactions in addition to H-bonding in base pairing. Additionally, they designed a modified З base, 9-methyl-1Х-imidazo[4,5-б]pyridine (Q), that has a proton acceptor corresponding to the N3 atom. 14) Because the incorporation efficiency of Q by Klenow fragment (KF) DNA polymerase is superior to that of З, the importance of proton acceptors in the minor groove for unnatural base pair design is also demonstrated.

To further evaluate the importance of shape complementarity in base pairing, they also created size-expanded (benzo-fused) WC-like base pairs, such as xA : T and A : xT pairs (termed xDNA), that have the same H-bonding geometry as natural WC base pairs but with their pairing edges shifted outward by 2.4 Å (яғни, the width of benzene) 15,16) (Fig. 2B). KF polymerase incorporated natural nucleoside triphosphate (dNTP) opposite xDNA bases in a DNA template with an efficiency ca. 1000-fold lower than that of natural pairs, 16) and endogenous ішек таяқшасы (E. coli) enzymes accurately transcribed xDNA to encode the bacteria phenotype. 17)

2.3. Creation of a Semi-synthetic Organism with an Unnatural Base Pair Romesberg’s Group

Romesberg and colleagues have also developed various kinds of non-H-bonded unnatural base pairs. In 1999, they reported the self-complementary 7-propynylisocarbostyril (PICS) : PICS pair 18) (Fig. 3). Қашан PICS : PICS base pairs are incorporated into DNA, the resulting duplex shows high thermal stability, and KF polymerase recognizes the PICS : PICS pair as a complementary base pair. However, further replication reactions after PICS : PICS base pairing are terminated because PICS bases overlap with each other, indicating structural change in the DNA duplex. Consequently, they explored more than 100 kinds of unnatural base pairs 19–25) and succeeded in developing 5SICS : MMO2 және 5SICS : NaM pairs, which are replicable unnatural base pairs in the PCR. 26–28) In 2014, they reported the creation of a semi-synthetic organism containing the 5SICS : NaM base pair. In this work, an exogenously expressed nucleoside triphosphate transporter imported d5SICS and dNaM triphosphates efficiently into E. coli, and an endogenous replication system used them in the genetic codes. 29) This report had a great impact on synthetic biology, and some researchers consider the created organism to be “alien.”

2.4. Unnatural Base Pair as a Powerful Tool for Creating Highly Functional Nucleic Acids Hirao’s Group

Hirao т.б. have also focused on the creation of unnatural base pairs that function in replication, transcription, and translation in the same way as natural WC base pairs. Their unnatural base pairs were developed by exploiting the concept of steric hindrance. In their 2-amino-6-(2-thienyl)purine (с) : 2-oxo-1Х-pyridine (ж) pair, the purine-like с has a bulky substituent at the major groove side 30,31) (Fig. 4). Осылайша, с : ж pair is selectively recognized as a complementary base pair by KF polymerase in in vitro replication systems. Furthermore, in 2002 they succeeded in synthesizing the Ras protein modified with 3-iodotyrosine from a DNA template containing the с base by combining T7 polymerase transcription and E. coli in vitro translation systems. 32) They also developed the Ds : Pa base pair, in which H-bonding atoms and substituents located at the base-pairing side are excluded. 33) The replication selectivity of the Ds : Pa pair is superior to that of the с : ж pair, and the Ds : Pa pair can be amplified in the PCR with over 99% fidelity per doubling using γ-amino triphosphates of Ds and A. 33) Concerning selectivity in replication, their unnatural base pairs exhibit the best performances among the reported unnatural base pairs. The low misincorporation rate of the recently developed Ds : diol1-Px pair (5×10 −5 errors/bp) is close to the mispairing error rate of natural WC pairs (2×10 −5 errors/bp). 34,35) By making use of this superior property of the Ds : diol1-Px pair, they succeeded in obtaining a DNA aptamer containing the Ds base against human protein target, vascular endothelial cell growth factor-165 (VEGF-165). 36) Because the affinities of aptamers that have Ds bases are >100-fold improved over those of aptamers containing only natural bases, the potential of genetic alphabet expansion as a powerful tool for creating highly functional nucleic acids is demonstrated.

In contrast to the research described above, we began our unnatural base pair studies to address the simple question : why did WC base pairs come to contain two or three H-bonds during the evolution of life? To answer this, we have explored four H-bonding base pairs. 37–41) As purine-type nucleobases, a series of imidazo[5′,4′:4.5]pyrido[2,3-г]pyrimidines (Im) were designed, 37) while 1,8-naphthyridines (Na) were designed as their complementary pyrimidine nucleobases. 38) For the first generation of our four-H-bonding unnatural base pairs, two Im : Na pairs, яғни, ImN O : NaO N және ImO N : NaN O , which have alternate H-bonding geometries, were developed. As can be seen in Fig. 5a, these pairs have four non-canonical H-bonds and expanded aromatic surfaces, and they satisfy the shape complementarity criterion like WC base pairs. Because of the contributions of these effects, DNA duplexes containing these pair(s) are significantly thermally stabilized (ca. +8°C/pair). 38) In addition, both pairs are recognized by KF polymerase as complementary in single nucleotide insertion. However, the kinetic parameters determined for their 5′-triphosphates revealed that the efficiencies of incorporation for ImN O : NaO N және ImO N : NaN O pairs are 1–2 orders of magnitude lower than those of natural A : T and G : C pairs. Furthermore, misincorporation of natural dNTP, for example, that of 2′-deoxyadenosine 5′-triphosphate (dATP) against NaN O in the template was clearly observed at the same efficiency as that of ImO N TP қарсы NaN O in the template owing to the possible formation of an A : NaN O pair with two H-bonds 42,43) (Fig. 5b).

To improve efficiency and selectivity, a new Im : Na pair, яғни, ImN N : NaO O , has been envisioned 39,44) (Fig. 5c). This pair has a [DAAD : ADDA] H-bonding geometry, and thus is expected to avoid the misincorporation of natural A and G (Fig. 5d). The chemistry and enzymatic behavior of the ImN N : NaO O pair is described below.

3.1. Synthesis of the Nucleoside Units for the ImN N : NaO O Pair

The most straightforward synthesis of ImN N nucleoside 1 is thought to be through intramolecular cyclization of the 5-pyrimidinylimidazole nucleoside, which can be prepared арқылы Stille coupling between the 5-iodoimidazole nucleoside 2 and (tributylstannyl)pyrimidine 3 (Chart 1). When a mixture of 2 prepared from 2′-deoxyinosine and 3 prepared from 2,4-dichloropyrimidine is heated in Н,Н-dimethylformamide (DMF) in the presence of tris(dibenzylideneacetone)dipalladium(0)-chloroform adduct (dba3Pd2·CHCl3), a mixture of coupling product 4 and a spontaneously cyclized tricyclic product 5 is obtained. Subsequent treatment of the mixture under basic conditions converges the mixture to the tricyclic product 5. Finally, treatment of 5 with a mixture of 1,4-dioxane and NH4OH gives the desired ImN N nucleoside 1 in good yield. 37) The resulting 1 is then converted into the corresponding phosphoramidite unit and 5′-triphosphate under the appropriate conditions. 44,45)

Reagents and conditions: (a) dba3Pd2·CHCl3, DMF, 100°C (b) Na2CO3, aq. EtOH, 80°C (c) NH4OH/1,4-dioxane, 100°C.

For the synthesis of NaO O nucleoside 6, which is an unusual C-nucleoside, the palladium-catalyzed Heck reaction was envisioned. As illustrated in Chart 2, 3-iodo-1,8-naphthyridine derivative 7 prepared from 2-amino-7-hydroxy-1,8-naphthyridine and glycal 8 are prepared. Then, Heck coupling of 7 бірге 8 in the presence of palladium acetate and triphenylarsine followed by deprotection and stereoselective reduction affords 1,8-naphthyridine C-nucleoside 9. After protection of the hydroxyl groups with silyl groups to give 10, the substituent at the 2-position is converted into an acetoxy group арқылы 11. Finally, treatment of the resulting 12 with methanolic ammonia at 60°C in a sealed tube gives the desired NaO O nucleoside 6 in good yield. In a similar manner as for 1, 6 is converted into the corresponding phosphoramidite unit and 5′-triphosphate for enzymatic evaluation. 39,45)

Reagents and conditions: (a) Pd(OAc)2, AsPh3, Bu3N, DMF, 60°C (b) TBAF, THF (c) NaBH(OAc)3, AcOH, CH3CN (d) TIPSCl, imidazole, DMF, 55°C (e) NH3/MeOH, 80°C (f) NaNO2, AcOH (g) NH3/MeOH, 80°C.

3.2. Investigation of Single Nucleotide Insertion with the ImN N : NaO O Pair

To investigate the efficiency and selectivity of the newly designed ImN N : NaO O pair in in vitro replication systems, we examined single nucleotide insertion using KF polymerase, and the kinetic parameters, such as the Michaelis constant (Қм), the maximum rate of the enzyme reaction (Вмакс), and the incorporation efficiency (Вмакс/Қм), for the ImN N : NaO O pair were determined and compared with those of the two previous Im : Na pairs 45) (Fig. 6). As discussed above, the values of Вмакс/Қм үшін ImN O : NaO N pair are 1–2 orders of magnitude lower than those of the natural A : T pair (6.0×10 7 –9.0×10 7 % min −1 M −1 ), as presented in the first row of Fig. 6. This result is thought to be due to the fact that the NaO N base lacks a proton acceptor corresponding to the O2 atom of the natural pyrimidine base. үшін ImO N : NaN O pair, the Вмакс/Қм values are better than those for the ImN O : NaO N pair (second row in Fig. 6). However, as well as the desired ImO N , undesired A is incorporated against NaN O in the template with a comparable Вмакс/Қм value (Fig. 5b).

a) Incorporation of dYTP against a series of Im bases in the template. b) Incorporation of dYTP against a series of Na bases in the template. a n.d.=not determined.

Concerning incorporation efficiencies, the Вмакс/Қм values for the ImN N : NaO O pair are superior to those for the ImN O : NaO N және ImO N : NaN O pairs because the ImN N және NaO O bases have proton acceptors at positions corresponding to the N3 of a purine and the O2 of a pyrimidine, respectively. Сонымен қатар, ImN N : NaO O pair has higher thermal stability than the two previous Im : Na pairs owing to the [DAAD : ADDA] H-bonding pattern. 39) The preferable base-pairing properties of the ImN N : NaO O pair lead to it having the highest incorporation efficiency among the three Im : Na pairs. With respect to specificity, misincorporations of natural A and/or G against ImN N in the template are controlled by the [DAAD : ADDA] H-bonding pattern of the ImN N : NaO O жұп. The efficiency of ImN N TP incorporation against NaO O is at least ten-times higher than those of natural dATP and 2′-deoxyguanosine 5′-triphosphate (dGTP) incorporations. Thus, as expected from Fig. 5d, formation of both A : NaO O and G : NaO O should be negligible owing to the NH proton repulsion between the 6-amino group of A and N8 of NaO O , and that between N1 of G and N1 of NaO O , тиісінше.

3.3. PCR Amplification with ImN N : NaO O Pair

To apply the newly developed ImN N : NaO O pair to synthetic biology research like that reported by the four aforementioned groups, this pair should be viable in PCR amplification. Thus, according to the method reported by Hirao т.б., 34) PCR involving the ImN N : NaO O pair was examined under various dNTP conditions (Fig. 7a).

(a) Schematics of the template and primers, and the resulting amplicon. Gel electrophoresis of PCR products obtained using Taq DNA polymerase (b), Deep Vent exo − DNA polymerase (c), Deep Vent exo + DNA polymerase (d), and Pfx 50 DNA polymerase (e) under different dNTP conditions.

First, when Taq DNA polymerase, which is a standard thermophilic DNA polymerase for routine PCR, is used, a 75 base-pair amplicon in the presence of ImN N TP and NaO O TP along with all four kinds of dNTPs is successfully obtained (Fig. 7b, lane 4). However, similar PCR products are observed under the conditions lacking ImN N TP (lane 3), indicating that inaccurate amplification occurs, presumably owing to misincorporation of natural A and/or G against NaO O in the resulting DNA fragment. Thus, we screened suitable thermophilic DNA polymerases, and typical results are shown in Figs. 7c–e. Exonuclease-deficient Deep Vent (Deep Vent exo − ) DNA polymerase gives the full-length amplicon in both the presence and absence of NaO O TP (Fig. 7c). Conversely, the same polymerase with 3′→5′ exonuclease activity (Deep Vent exo + ) preferentially affords the PCR product in the presence of all 5′-triphosphates (Fig. 7d), suggesting that the proofreading activity identifies mismatched base pairs with natural nucleobases and corrects them to the ImN N : NaO O жұп. It has been reported that the proofreading activity of DNA polymerases improves the accuracy of incorporating unnatural base pair analogs, 32,33) and the benefits of this activity are apparent in our case.

To further evaluate the fidelity of the ImN N : NaO O pair in PCR amplification, we sequenced the resulting PCR product according to methods reported by the groups of Benner 26) and Hirao. 34) As a result, the lowest total mutation rates of the ImN N : NaO O pair is observed when using Pfx 50 DNA polymerase, and it is estimated to be ca. 6% after 15 PCR cycles (fidelity ≈0.995 per doubling) (the analysis of PCR products by gel electrophoresis is shown in Fig. 7d). Although the replication fidelity of the ImN N : NaO O pair is slightly inferior to those of other unnatural base-pair analogs, 8,9,26,28,34,46,47) it is strongly indicated that the ImN N : NaO O pair acts as an orthogonal base pair for WC base pairs during PCR amplification.


Бейнені қараңыз: Орифлэйм каталогынан МЕНІҢ ТОП-10 ӨНІМДЕРІ # 3-2021 (Қаңтар 2022).