Ақпарат

Менің DIY үшін қолайлы CaCl2 құзыретті жасушаны дайындау және жылу соққысы протоколын жақсарту

Менің DIY үшін қолайлы CaCl2 құзыретті жасушаны дайындау және жылу соққысы протоколын жақсарту


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Мен өз қолыммен қолайлы E. coli кальций құзыреттілігі мен жылу соққысы протоколын әзірлеу үстінде жұмыс істеп жатырмын және кейбір аралас нәтижелерге қол жеткіздім. Мен трансформация жылдамдығын ықтимал ақауларды жою және жақсарту туралы идеяларды іздеп жүрмін.

Мен төмендегі хаттаманың көптеген ауыстыруларын сынап көрдім, бірақ дәйекті нәтиже беретін хаттаманы толық анықтай алмаймын.

Міне, мен өз қолөнер ортамда жұмыс істейтін шектеулер:

  • -80c мұздатқышқа кіруге болмайды. Көптеген хаттамалар басында ұяшықтардың үлкен партиясын дайындауды, содан кейін олардың трансформацияларында мұздатылған аликвоттарды пайдалануды талап етеді. Бейімделу үшін мен құзырлы жасушаларды аз мөлшерде дайындап жатырмын, содан кейін бірден жылу соққысы.
  • Арнайы медиа жоқ (қалпына келтіру үшін тек LB пайдалану)
  • Тек тоңазытқышта емес, максимум 7к айн/мин микроцентрифуга болуы керек
  • Белгісіз ДНҚ концентрациясы (пайдалану арасында -20c мұздатылған жаңа шағын прептерді пайдалану)
  • Шейкерсіз DIY-инкубаторды пайдалану (температура 32-34c температурада өзгереді)
  • Өлшемі 5кб-9кб аралығындағы плазмидалармен dh5α пайдалану

Міне, менің жалпы жасушалық құзыреттілікке дайындық және жылу соққысының протоколы:

  1. Пластинаны dh5α сызыңыз, 24-30 сағат бойы инкубациялаңыз
  2. Алдын ала салқындатылған 1,5 мл Epp түтігіне 300ул мұздай 100мМ CaCl2 қосыңыз.
  3. Пластинкадан түтікке 1-2 ішек таяқшасын қосыңыз
  4. Мұзда 30 минут ұстаңыз
  5. 1-2ул минипреп плазмидін қосып, ақырын сипап өтіңіз
  6. 10 минутқа мұз
  7. Түтіктерді жұмсақ қозғалыспен 42 градус су моншасына 30 секундқа салыңыз
  8. Бірден мұзға 2 минут қойыңыз
  9. 400ул бөлме температурасында LB қосыңыз
  10. 45 минут бойы инкубациялаңыз
  11. Антибиотик пластинкасына 130ул пластина, бақылауға 50ул

Тестілеуімде мен ешқандай өзгерістерге ұшырамаймын. Бұл соққы немесе жіберіп алу. Менің бақылауым процедурадан кейін жасушаларымды өлтірмейтінімді көрсетеді.

Мен сондай-ақ 6 сағат бойы инкубацияланған сұйық культурадан 1,5 мл түтіктерді дайындап көрдім және өз жасушаларыма пластинадағы колонияны қолдануға тырыстым және бұл жылдамдықты жақсартуға көмектесетін сияқты; дегенмен, жоғарыдағы колония әдісі бірнеше рет жұмыс істеді және әдетте оңай/тезірек.

Менде болған тағы бір мәселе, мен колонияларды CaCl2-ге тасымалдау үшін циклды пайдаланған кезде, тым агрессивті болмай, шоғырларды бұзу қиын болуы мүмкін. Мен жартылай біртекті шешім алу үшін ішке/шығаруға, сондай-ақ циклды айналдыруға тырыстым.

Мен CaCl2 мен жасушалардың ДНҚ-ға дұрыс қатынасын қолданамын ба? Мұнда жақсартуға немесе ақауларды жоюға болатын нәрсе бар ма?

*Өңдеу * Жоғарыдағы хаттама келесі көздерден алынған бейімделу болып табылады: https://lchenlab.sitehost.iu.edu/protocol_files/preparing_competent_cells.htm https://cmbe.engr.uga.edu/protocols/CaCl2%20Competent%20Cells .pdf http://mcb.berkeley.edu/labs/krantz/protocols/calcium_comp_cells.pdf


Сауатты жасушалар CaCl2 қалай жасайды?

Құзыретті жасушалар. E. coli жасушалар егер олардың бөтен ДНҚ-ны қосу ықтималдығы жоғары ұяшық қабырғалары ДНҚ оңай өтуі үшін өзгереді. Мұндай жасушалар деп айтылады»құзыретті." Жасушалар болып табылады құзыретті етті кальций хлориді және жылу соққысын пайдаланатын процесс арқылы.

Сондай-ақ, сіз cacl2 автоклав жасай аласыз ба? Барлық жауаптар (9) It болар еді тек тұнба егер карбонатты түзді. Ол жасай алады бұл ауадан көмірқышқыл газын сіңірген суда. Бұл болар еді кезінде айдауға болады автоклавтау, бірақ сүзу арқылы емес. Сіз автоклав жасай аласыз CaCl2, өйткені мүмкін өнімдер Ca(OH)2 және CaCO3 HCl-мен әрекеттесіп, CaCl түзеді2.

Сонымен қатар, бұл тәжірибеде кальций хлоридінің рөлі қандай болды?

Сусыз кальций хлориді түтік реакциялық ыдыс пен атмосфераның арасына қойылады. Бұл реакция ыдысына ылғалдың түсуін болдырмау үшін қажет.

Жылу соққысы жасушаларды қалай сауатты етеді?

Зертханада бактериялық жасушалар бола алады құзыретті етті және ДНҚ кейіннен деп аталатын процедура арқылы енгізілген жылу соққысы әдіс. Температураның кенеттен жоғарылауы бактериялардың плазмалық мембранасында тесіктер жасайды және плазмидтік ДНҚ-ның бактерияға енуіне мүмкіндік береді. ұяшық.


Құзыретті жасушаларды дайындау

2-күн 1. Бір колониядан жасушаларды жинау үшін стерильді егу ілмегін пайдаланыңыз және 50 мл стерильді 1X LBM Grow 37 градус C температурада түнде (16-20 сағат) шейкер инкубаторында егіңіз. Сондай-ақ инкубаторға ортаның температурасын теңестіру үшін 250 мл 1X LBM 2 колбаны салыңыз.

  1. Әрбір 250 мл LBM колбасына 25 мл түнгі культураны қосыңыз. Ортаның температурасын теңестіру үшін инкубаторға 150 мл 1X LBM басқа колбаны салыңыз. Дақылдарды OD650 = O.2 дейін өсіріңіз. (шамамен 3 сағат тығыз емес). Әр колбаға 75 мл теңестірілген 1X LBM қосыңыз және 30 минут бойы инкубациялауды жалғастырыңыз.
  2. Бекман J-6 центрифугасы мен JA 10 роторын (суық болуы керек!) пайдаланып, салқындатылған автоклавталған үлкен центрифугалық бөтелкелерде жасушаларды 10 минут бойы 5000 айн/мин жылдамдықпен түйіршіктеңіз. Кейінгі қайта суспензияларды бір бөтелкеде жасауға болады. Процедураның қалған бөлігінде жасушалар суық күйінде қалуы керек: Түтіктерді мұзда тасымалдаңыз және салқын бөлмеде мұзда қайта суспензиялаңыз.
  3. Супернатанды төгіп, жасушаларды 1/4 бастапқы көлемде (87,5 мл) мұзда 100 мМ MgCl2 қайта суспензияға түсіріңіз. Мұзда 5 минут ұстаңыз. Жасушаларды алдын ала салқындатылған стерильді үлкен центрифугалық бөтелкелерге тасымалдаңыз. Beckman J-6 центрифугасында JA-20 роторын 4000 айн/мин 4 градуста пайдаланып 10 минут айналдырыңыз.
  4. Жоғарғы сұйықтықты төгіп, жасушаларды 1/20 бастапқы көлемде (17,5 мл) мұздатылған 100 мМ CaCl2 суспензиясына салыңыз. Мұзда 20 минут ұстаңыз. 10 минут бойы 4000 айн/мин жоғарырақ түйіршіктер.
  5. Супернатантты декантациялаңыз және жасуша түйіршіктерін 1/100 бастапқы көлемде (3,5 мл) ерітіндіде қайта суспензиялаңыз, ол 85% т/ж 100 мМ CaCl2 және 15% глицерин (100%). Әрбір өңделген культура үшін құрғақ мұз-EtOH ваннасында шамамен таңбаланған 15 эппендорф түтігін салқындатыңыз. Әр түтікке 300 ul ұяшықты тамызып, дереу құрғақ мұз-EtOH ваннасына салыңыз. Мұздатылған құзырлы жасуша аликвоталарын -80 градусқа дейін тасымалдаңыз.
  6. Құзыретті жасушалар 24 сағат бойы сақталғаннан кейін трансформация тиімділігін тексеріңіз: 1 нг 10 нг және 100 нг ампициллинге төзімді кез келген плазмидті LBM + Amp пластиналарында зақымданбаған плазмидалар үшін трансформация протоколына сәйкес пайдаланыңыз. LBM + Amp пластинасында 50 ul ұяшықтарды тек қана жабу арқылы фон деңгейін тексеріңіз. Өнімділік өте ширатылған ДНҚ-ның бір мг үшін шамамен 5x10e7 колония болады деп күтіңіз.

Шешімдер:

  1. 100 мМ MgCl2:
    • Зертхана қорын 1:10 сұйылту үшін стерильді ингредиенттерді немесе сүзгіні пайдаланыңыз
    • зарарсыздандыру
  2. 100 мМ CaCl2:
    • Зертхана қорын 1:10 сұйылту үшін стерильді ингредиенттерді немесе сүзгіні пайдаланыңыз
    • зарарсыздандыру
  3. 85% 100 мМ CaCl2, 15% глицерин:
    • 42,5 мл 100 мМ CaCl2
    • 7,5 мл 100% глицерин
    • 50,0 мл жалпы көлемі жақсылап араластырыңыз және стерильді ингредиенттерді пайдаланыңыз немесе сүзгіден өткізіңіз

Сақтық шаралары:

Плазмидтік/ғарыштық ДНҚ биоқауіпті деп саналып, қалдықтарды тиісті түрде жою керек.


Нәтижелер

Температураның ығысуының электрокомпетентті жасушаларға әсері

Электркомпетентті ұяшықтарды дайындау, сақтау және тасымалдау үшін төмен температуралық жағдайларды сақтау ыңғайсыз болды. Біз бөлме температурасында дайындалған электрокомпетентті жасушалардың трансформация тиімділігін тексеруді көздедік. Үлкен плазмида pGB-amp-Ptet-plu1880 (27,8 кб) түрленді. E. coli GB2005 штамм 17,24 әртүрлі температурада. Жылы электрокомпетентті ұяшықтар суық электрокомпетентті ұяшықтарға қарағанда 10 есе жоғары трансформация тиімділігін көрсетті (1а-сурет). Салқын электрокомпетентті ұяшықтарды бөлме температурасында 15 минутқа орналастырғаннан кейін трансформация тиімділігі 5 есе өсті (S1a сурет). Керісінше, бөлме температурасында электрокомпетентті жасушалар электропорация алдында 15 минут мұзға орналастырылғаннан кейін трансформация тиімділігінің айтарлықтай төмендеуі байқалды (S1b-сурет).

(а) Температураның әсері, E. coli Трансформацияланған GB2005 ұяшықтары

0,1 мкг pGB-amp-Ptet-plu1880 (27,8 кб) күшейткіш пластиналармен қапталған. 1, электрокомпетентті ұяшықтарды 2 дайындаудың қалыпты мұздай салқын әдісі, 1 сияқты, бірақ жасушалар электропорациядан бұрын 3, 1 сияқты, мұзда 15 минут ұсталды, бірақ жасушалар электропорация алдында 15 минут бойы бөлме температурасында (RT) орналастырылды. кюветалар RT 4-те пайдаланылды, әрбір қадам RT 5-те жасалды, плазмидтік ДНҚ жоқ. (б) RT дайындалған жасушалар әртүрлі плазмидалармен түрлендірілді. 1, ампициллинге төзімділігі бар pBR322 шығу тегі (27,8 кб) 2, хлорамфениколға төзімді p15A шығу тегі (54,7 кб) 3, ампициллинге төзімділігі бар p15A шығу тегі (54,7 кб) 4, хлорамфениколға төзімді BAC (>120, BAC (канами5) төзімді) 91,7 кб) 6, ампициллинге төзімді BAC (91,7 кб). (в) Әртүрлі E. coli электропорациялық түрлендіру үшін сыналған штаммдар. Жасушалар 0,1 мкг pGB-amp-Ptet-plu1880 арқылы түрлендірілді және күшейткіш пластиналармен қапталды. Қате жолақтары, SD n = 3.

Лабораториямыздағы бөлме температурасы 24 °C деп белгіленді. Құзыретті жасушаларды дайындау үшін оңтайлы температура диапазонын анықтау үшін біз жасушаларды әртүрлі температура диапазонында дайындадық және электрокомпетентті жасушаларды дайындау үшін ең жақсы температура 24°–28 °C диапазонында екенін анықтадық (S2 сурет).

Әртүрлі плазмидалардың электрокомпетентті жасушаларға әсері

Плазмидалар мөлшері, таңдау маркері және репликацияның шығу тегі бойынша әр түрлі болды. Бастапқыда біз өлшемдері әртүрлі үш плазмиданы сынадық. Олардың екеуі ампициллин (амп) немесе левомицетин (см) төзімділігі бар p15A тегі плазмидалары болды. Тағы біреуі ампициллинге төзімділігі бар pBR322 негізіндегі плазмида болды. Барлық плазмидалар бөлме температурасындағы электрокомпетентті жасушалармен жоғары трансформация тиімділігіне ие болды (сурет 1b, 1-3 баған). Біз сондай-ақ әртүрлі өлшемдері мен таңдау маркерлері бар BAC векторларын сынадық. Бөлме температурасы электрокомпетентті болғанда барлық BAC трансформация тиімділігі жоғары болды E. coli GB2005 ұяшықтары пайдаланылды (1b-сурет, 4-6 баған). Бұл нәтижелер электрокомпетентті түрлендіру үшін бөлме температурасындағы электрокомпетентті жасушалар өлшеміне, таңдау маркеріне және репликацияның шығу тегіне қарамастан суық электрокомпетентті жасушаларға қарағанда тиімдірек екенін көрсетті. Сондықтан бөлме температурасындағы электрокомпетентті жасушалар суық электрокомпетентті жасушаларға қарағанда гендерді клондауға, ДНҚ кітапханаларын құруға және мутагенезге жақсы үміткер бола алады.

Әртүрлі штаммдардың электрокомпетентті жасушаларға әсері

The E. coli GB2005 плазмидті түрлендіру және тарату үшін оңтайландырылған штамм болды 17,25. Осы штамммен қатар, бірнеше басқа жиі қолданылады E. coli штаммдар бөлме температурасының өзгеруіне де сыналған. Нәтижелері әртүрлі болғанымен, бұл анықталды E. coli штаммдар салыстырмалы түрлендіру тиімділігінде әр түрлі болды, олардың барлығы электрокомпетентті ұяшықтары бөлме температурасында дайындалған кезде жоғары трансформация тиімділігін көрсетті (1c-сурет). Біз сонымен қатар бірнеше басқа грам-теріс бактерия штаммдарында жақсарту әдісін сынадық. Burkholderia glumae PG1 жуғыш зат липидазасын өндіруге арналған өнеркәсіптік штамм болды 26, ол сонымен қатар PKS/NRPS гендік кластерлердің экспрессиясы үшін пайдаланылатын гетерологиялық хост болуы мүмкін (жарияланбаған деректер). OriV текті плазмид pRK2Трансформация үшін pBC301 27,28 плазмидіне негізделген -апра-кан пайдаланылды. PG1 компетентті жасушалар бөлме температурасында дайындалған кезде ҚР электропорация тиімділігі2 плазмида мұзда дайындалған жасушалардан шамамен үш есе жоғары болды (S3a-сурет). Басқа грам-теріс бактерия штаммдары, мысалы Агробактерия 22 , Бурхолдерия 13 , Photorhabdus 23 және Ксенорхабдус 23 , ҚР бойынша сынақтан өтті2 бөлме температурасы мен суық температура протоколдарын қолдану арқылы плазмидті түрлендіру. Барлық нәтижелер бөлме температурасына қабілетті жасушалардың салқын құзырлы жасушаларға қарағанда трансформация тиімділігі жоғары екенін көрсетті (S3b-сурет).

Бөлме температурасындағы электрокомпетентті жасушаларды қолдану арқылы рекомбинирлеуді жақсарту

Бөлме температурасындағы электрокомпетентті жасушалар арқылы плазмидті трансформациялау тиімділігі айтарлықтай жоғарылады. Lambda Red немесе Rac RecET делдалдық рекомбинирлеуде бөлме температурасы протоколының жақсаруын бағалау қажет болды. Сызықтық вектордың ПТР өнімін (p15A ori плюс см немесе pBR322 ori плюс см) және канамицин (kan) бар ПТР өнімін қолданатын қарапайым талдау LLHR тиімділігін тексеру үшін жасалды 17 . E. coli GB05-дирмен штамм реcОның хромосомасындағы ET LLHR сынағы 25 үшін пайдаланылды. Нәтижелер бөлме температурасында сауатты жасушалардағы LLHR мұзда дайындалған жасушаларға қарағанда 6-10 есе тиімді екенін көрсетті. p15A және pBR322 шығу тегі плазмидалары бірдей қатпарлық өсімге ие болды (2а,б-сурет). Таиланддепсин генінің кластерін шығаруға арналған тікелей клондау эксперименті (

39 кб) бастап Burkholderia thailandensis орындалды, суық электрокомпетентті жасушаларды қолдану арқылы 150-ге жуық колониялар алынды, бірақ бөлме температурасында электрокомпетентті жасушаларды пайдалану арқылы 600-ден астам колониялар алынды. Бұл жақсарту геномдық ДНҚ пулдарынан тікелей үлкен ДНҚ фрагменттерін клондау мүмкіндігінің жоғарылауына әкеледі.

(а) Стандартты LLHR талдауының колония нөмірі GB05-дирде қалыпты және суық әдістен 17 E. coli. (б) А үшін, бірақ pBR322 шығу тегі бар. (в) A үшін, бірақ GB05-қызыл стандартты LCHR талдауымен. (г) Электркомпетентті жасушалар алдымен мұзда дайындалды. ПТР өнімінің кан кассетасын мұздай салқын электрокомпетентті жасушаларға қосқаннан кейін жасушалар мен ДНҚ қоспасы электропорация алдында RT-ге 3 минутқа ауыстырылды (ортаңғы баған). КТ, Суық температура RT, Бөлме температурасы. Қате жолақтары, SD n = 3.

ПТР клондау - бұл әрбір молекулалық биология зертханасында әдеттегі жаттығу 20. Осылайша, ПТР өнімдерін клондаудың оңай және арзан әдісін табу біздің мүдделі. Бөлме температурасында дайындалған электрокомпетентті ұяшықтар LLHR тиімділігін шамамен 10 есе жақсартатындықтан, LLHR үшін қажетті ең аз гомологиялық тізбектерді табу өте маңызды. Бұрын біз 29,30 рекомбинирлеу үшін қажетті реттілік гомологиясының ең аз ұзындығы ретінде 20 bp анықтадық. Минималды ұзындықты одан әрі қысқартуға болатынын тексеру үшін pBAD24 векторы сызықтық реципиент ретінде EcoR I/Hind III арқылы қорытылды, ал ПТР өнімінің кассетасы (Tn5-neo) қорытылған pBAD24 векторының ұштарына қысқа гомологиялық иықпен қапталдалған. донор фрагменті (S4-сурет). LLHR тиімділігін сынау үшін әртүрлі өлшемдегі гомологиялық тіректері (HA) бар жеті ПТР өнімі жасалған. Нәтижелер бөлме температурасының протоколы арқылы терминал гомологиясының тек 8 бит жеткілікті екенін көрсетті (S5-сурет). Мұзды салқын ұяшықтарды пайдаланған кезде, рекомбинирлеуге қажетті ең аз гомологиялы тұтқалар 12 bp табылды. Бұл деректер LLHR-ны ПТР өніміне арналған жиынтықты жасау үшін немесе 8 бит-ке дейін қысқа гомологиялық тұтқаларды пайдалану арқылы шағын ДНҚ фрагменттерін клондау үшін пайдаланылуы мүмкін екенін көрсетті.

LLHR тәжірибесінен айырмашылығы, LCHR тиімділігі салқын протоколмен салыстырғанда бөлме температурасының протоколында жоғарылаған жоқ (Cурет 2c). Дегенмен, біз жаңадан дайындалған салқын электрокомпетентті жасушаларды бөлме температурасында 3 минутқа қойғанда LCHR тиімділігі айтарлықтай көтерілетінін анықтадық (2d-сурет), бұл жасушалардың өтпелі ісінуінің пайдалы әсер еткенін көрсетті.

Бөлме температурасындағы электрокомпетентті жасушалардың тұрақтылығы

Әдетте, 37 °C температурада 2,5-3,0 сағат өсіруден кейін, E. coli GB2005 OD деңгейіне жетті600 0,4–0,6 лог фазасында, жасушалардың трансформация тиімділігінің ең жақсы кезеңі болды. Бактерия жасушалары шамадан тыс өсіп кеткенде, трансформация тиімділігі төмендеді (S6a-сурет), ал суық электрокомпетентті жасушалардың трансформация тиімділігі 4 сағаттан немесе 6 сағаттан кейін толығымен жоғалды (тек тиісінше 18 және 5 колония) (S6a-сурет). Бірақ бөлме температурасындағы электрокомпетентті жасушалар 4 немесе 6 сағат өсіруден кейін де салыстырмалы түрде жоғары тиімділікті сақтайды. E. coli GB2005 4 сағат бойы 37 °C температурада ОД деңгейіне жетті600 1.0

1,2 және 6 сағат бойы культивацияланған ОД жетті600 > 1,8, ол плато фазасында болды. Құзыретті жасушаларды дайындау үшін бөлме температурасының протоколы пайдаланылған кезде, шамадан тыс өскен немесе тіпті түнде өсірілген бактериялық жасушалар әлі де трансформация үшін пайдаланылуы мүмкін екендігі назар аударарлық болды.

Трансформация процесін болжау үшін біз қалпына келтіру қадамын өткізіп жіберуге болатынын тексердік. Қарапайым плазмидті түрлендіру үшін электрокомпетентті ұяшықтар бөлме температурасының протоколын қолдану арқылы дайындалған кезде қалпына келтіру қадамын өткізіп жіберуге болады (S6b-сурет). Қалпына келтірілмейтін бөлме температурасы тобындағы трансформация тиімділігі қалпына келтіру бөлмесінің температурасы тобына қарағанда шамамен 30%-ға аз болғанымен, қалпына келтіру немесе қалпына келтіру емес, суық температура тобымен салыстырғанда ол әлі де кем дегенде 5 есе жоғары болды. Нәтижелер бөлме температурасында құзырлы жасушаларды пайдалану арқылы электропорациядан кейін бірнеше минут ішінде плазмида немесе лигатура трансформациясын орындауға болатынын көрсетті. Алдыңғы нәтижелер бөлме температурасындағы электрокомпетентті жасушалардың салқын электрокомпетентті жасушаларға қарағанда әлдеқайда жақсы трансформация тиімділігін көрсетті. Сонымен қатар, біз құзыретті жасушалардың трансформация тиімділігін айтарлықтай жоғалтпай бөлме температурасында қанша уақыт тұра алатынын білгіміз келді. Нәтижелер бөлме температурасында сауатты жасушалар бөлме температурасында 1 сағат сақтаудан кейін шамамен 30% тиімділікті жоғалтқанын, 4 сағаттан кейін шамамен 60% және бір күннен кейін шамамен 80% жоғалтқанын көрсетті (S7-сурет). Бұл нәтижелер бөлме температурасында құзырлы жасушалар бір тәуліктен артық бөлме температурасында сақталған кезде трансформация тиімділігін барынша жоғалтқанын көрсетті. Бұл тиімділікті жоғалтпау үшін бөлме температурасына сәйкес келетін ұяшықтар 10% глицерин 11 арқылы дайындалды және вакуумда кептірілді және 4 ° C температурада үш күнге дейін сақталды. Нәтиже 10% глицеринде дайындалған кептірілген бөлме температурасындағы құзырлы жасушалар құрғақсыз бөлме температурасына жарамды жасушалармен салыстырғанда 55% тиімділігін жоғалтқанын көрсетті (S2 кесте). Бір қызығы, 10% глицеринде дайындалған кептірілген құзырлы жасушалар LLHR тиімділігін одан әрі тиімділікті жоғалтпай 3 күнге дейін сақтай алады (S3 кесте). Бұл мүмкіндік бізге болашақта қарапайым салқындату пакетінде сауатты ұяшықтарды жеткізуге мүмкіндік береді, бұл оңай және үнемді.

Құзыретті жасушалардың электронды микроскопиялық талдауы

Бөлме температурасы протоколында жоғары тиімділіктің себептерін табу үшін электронды микроскопия суық компетентті жасушалардың морфологиялық пішіндерін және бөлме температурасына сәйкес келетін жасушалардың салыстырмалы талдауы үшін пайдаланылды. E. coli. Олардың салыстырмалы талдауы салқын құзыретті жасушалар бөлме температурасындағы жасушаларға қарағанда көбірек кішірейетінін көрсетті, ал бөлме температурасына қабілетті жасушалардың беті тегіс болды (3a-d-сурет). Жиырылған жасушаларды түрлендіру қиынырақ болуы мүмкін, ал бактериялық жасуша мембранасы мен қабырғасы жоғары температурада бөтен ДНҚ енуі үшін көбірек өткізгіш болуы мүмкін. Сонымен қатар, кішірейген жасушалар үшін электропорация жағдайында жасуша мембранасы арқылы ДНҚ тасымалдауға мүмкіндік беретін кеуектерді қалыптастыру қиын болуы мүмкін, ал электропорациядан кейін суық құзыретті жасушалардың көпшілігі лизиске ұшырады. (3e,f-сурет). Бұдан біз бактерия жасушасының мембранасы/жасуша қабырғасы бөгде заттардың жасушаға енуі үшін жақсы өткізгіштікке ие болуы мүмкін деп есептейміз.

(аг): әртүрлі ұлғайтумен салқын және бөлме температурасының протоколдарымен жуылған жасушалардың микросуреті. (ef): эпизомды енгізу ДНҚ-сы бар электропорацияланған жасушалар қоспасының микрографиясы.


Жылу соққы әдісін қолдану арқылы плазмидтік ДНҚ-ның ішек таяқшасына айналуы

Плазмидті ДНҚ-ны жылу соққысы әдісімен ішек таяқшасына айналдыру молекулалық биологияның негізгі әдісі болып табылады. Ол бактерияға бөгде плазмидті немесе байлау өнімін енгізуден тұрады. Бұл бейне хаттама Genlantis компаниясының коммерциялық қол жетімді химиялық сауатты бактерияларын қолданатын дәстүрлі түрлендіру әдісін сипаттайды. Мұздағы қысқа инкубациядан кейін химиялық сауатты бактериялар мен ДНҚ қоспасы 45 секундқа 42°C температурада (жылу соққысы) орналастырылады, содан кейін қайтадан мұзға салынады. SOC ортасы қосылады және трансформацияланған жасушалар араластыра отырып, 37 ° C температурада 30 минут бойы инкубацияланады. Трансформация тиімділігіне қарамастан, колонияларды оқшаулауды қамтамасыз ету үшін трансформацияланған бактериялардың екі саны қапталады. Бұл дәстүрлі протоколды көптеген коммерциялық қол жетімді құзыретті бактерияларды түрлендіру үшін сәтті пайдалануға болады. Genlantis турбоклеткаларын нұсқаулықта сипатталған жаңа 3 минуттық түрлендіру протоколында да қолдануға болады.


Канамицин антибиотикі жасушаларды қалай өлтіреді?

Канамицин (және оның аминогликозидтер тұқымдасындағы туыстары антибиотиктер) рибосомалық РНҚ-мен тікелей байланысады және екеуі де трансляцияның басталуын тежейді және аминқышқылдарының қосылуында қателіктерді тудырады.

Трансформация тиімділігін не арттырады?

Грам-оң бактериялардың жасуша қабырғалары қалыңырақ болады, олар оң бояйды —, яғни олар Грам бояуы үшін бояуды сақтайды —. Грам-позитивті бактериялар көршілерін сауатты ететін құзыреттілік факторын тудырады, бұл артады the түрлендіру тиімділігі бүкіл колония.

Кальций хлориді қалай аталады?

CaCl2 күрделі атау болып табылады кальций хлориді. Ас тұзы сияқты, ол бөлме температурасында ақ кристалды, бірақ оны ерекшелендіретін қасиеттері бар. Жалпы Қолданулары Кальций хлориді. Несие: Nomad/E+/GettyImages. Кальций хлориді сода күлін, табиғи тұзды ерітіндіні немесе әктасты тазарту арқылы алуға болады.

Табиғатта бактериялық трансформация бола ма?

Трансформация реципиент жасушаның генетикалық өзгеруіне әкеледі. Экзогендік ДНҚ реципиент жасушаға оның қоршаған ортасынан жасуша мембранасы (лар) арқылы қабылданады. Трансформация табиғи түрде жүреді кейбір түрлерінде бактериялар, бірақ оған басқа жасушалардағы жасанды құралдар да әсер етуі мүмкін.

Плазмида неден тұрады?

Плазмидалар әдетте хромосомалық ДНҚ-ға тәуелсіз жасуша ішінде репликацияланатын бірнеше мың негіз жұптары бар дөңгелек, қос тізбекті ДНҚ молекулалары. Плазмида ДНҚ жасушалардан оңай тазартылады, жалпы зертханалық әдістерді қолдана отырып өңделеді және жасушаларға енгізіледі.

Жасушаны не қабілетті етеді?

Құзыретті жасушалар. E. coli жасушалар егер олардың бөтен ДНҚ-ны қосу ықтималдығы жоғары ұяшық қабырғалары ДНҚ оңай өтуі үшін өзгереді. Мұндай жасушалар “ деп айтыладықұзыретті.” Жасушалар болып табылады құзыретті етті кальций хлориді және жылу соққысын пайдаланатын процесс арқылы.

Бұл тәжірибеде хлорлы кальцийдің рөлі қандай болды?

Сусыз кальций хлориді түтік реакциялық ыдыс пен атмосфераның арасына қойылады. Бұл реакция ыдысына ылғалдың түсуін болдырмау үшін қажет.

Неліктен флакондар 10 минут бойы инкубацияланады?

Жасуша жарғақшаларын ДНҚ өткізгіштігін арттыру арқылы жасушаларды сауатты ету. Неліктен құтылар 10 минут бойы инкубацияланды олардың мазмұнын тікелей пластиналарға тасымалдаудың орнына LB сорпасында? Жасушаларға ампициллинге төзімділік генін шығаруға уақыт беру. Ампициллинсіз бактериялардың қалай өсетінін көру.

Неліктен бактериялық трансформация үшін cacl2 пайдаланамыз?

Кальций хлоридінің өзгеруі. Ол прокариоттық жасушаның плазмидтік ДНҚ-ны біріктіру қабілетін арттырады, бұл олардың генетикалық болуына мүмкіндік береді. түрлендірілген. Қосымшасы кальций хлориді жасуша суспензиясымен плазмидті ДНҚ-ның липополисахаридтермен (ЛПС) байланысуына ықпал етеді.

Жылу соққысы бактерияларға не береді?

Зертханада, бактериялық жасушаларды сауатты ету және ДНҚ кейіннен деп аталатын процедура арқылы енгізуге болады жылу соққысы әдіс. Температураның кенеттен жоғарылауы плазмалық мембранада кеуектерді тудырады бактериялар және плазмидтік ДНҚ-ның енуіне мүмкіндік береді бактериялық ұяшық.

Неліктен глицерин сауатты жасуша дайындауда қолданылады?

Глицерин криопротектор ретінде бактериялардың қату температурасын төмендетеді жасушалар, суперсалқындатуды жақсартады. Ол мұны су-су сутегі байланысымен бәсекелесе отырып, су молекулаларымен күшті сутектік байланыстар құру арқылы жасайды. Бұл температура айтарлықтай төмендемесе, мұздың кристалдық торының қалыптасуын бұзады.

Жоғарғы 10 ұяшық қалай сауатты болады?

  1. SOB пластинасында TOP10 жасушаларын сызып, 23°C температурада бір колониялар үшін өсіріңіз.
  2. 2 мл SOB қоректік ортасына бір колонияларды таңдап алып, 23°C түнде шайқаңыз.
  3. 15% дейін глицерин қосыңыз
  4. Nunc криотрубаларына 1 мл сынамалардың аликвоты.
  5. Түтіктерді құлыпталатын қапшыққа салыңыз, қапты құрғақ мұз/этанол ваннасына 5 минутқа батырыңыз.

Трансформация тиімділігі қалай есептеледі?

Трансформация тиімділігі болып табылады тиімділігі жасушалар жасушадан тыс ДНҚ-ны қабылдай алады және онымен кодталған гендерді экспрессиялай алады. Болуы мүмкін есептелген сәтті трансформацияланушылардың санын а кезінде пайдаланылған ДНҚ мөлшеріне бөлу арқылы түрлендіру процедура.


Бактериялық трансформацияның ашылу тарихы

Бактериялардың табиғи қабілеттілігі немесе трансформациялануы туралы алғаш рет 1928 жылы Фредерик Гриффит хабарлады [1]. Гриффит тышқандар «тегіс» пневмококкты инъекциялау кезінде өлетінін атап өтті (Streptococcus pneumoniae) (осыған байланысты вирулентті деп аталады), бірақ «дөрекі» штаммнан өлген жоқ (вирулентті емес). Тегіс штаммның вируленттілігін жылумен өлтіру арқылы жоюға болады. Алайда, жылумен өлтірілген тегіс штамм вирулентті емес өрескел штамммен араласқанда, өрескел штамм тегіс фенотипке ие болды және вирулентті болды (1-сурет). Гриффиттің эксперименттері трансформацияға тегіс штаммнан алынған тірі емес, ыстыққа төзімді материал жауапты екенін көрсетті. Тек 1944 жылы ғана бұл түрлендіргіш материалды Освальд Авери, Колин Маклеод және Маклин Маккарти ДНҚ ретінде анықтады [2].

Сурет 1. Гриффит тәжірибелері. Пневмококктың тегіс пайда болуы қожайынның иммундық жүйесі бактериялық жасушаларды тануға кедергі келтіретін полисахарид жабынының болуына байланысты.


Менің өз қолыммен қолайлы CaCl2 құзыретті жасушаны дайындау және жылу соққысы протоколын жақсарту - биология

E.coli кальций хлоридімен (немесе басқа химиялық өңдеу) өңдеу арқылы сауатты жасалған жасушалар болуы мүмкін бөгде ДНҚ-ны қабылдау арқылы өзгереді. Трансформация ДНҚ мен құзырлы жасушаларды араластырудың нәтижесі болып табылады, содан кейін қысқа жылу шокынан кейін температураның жылдам өзгеруі E.coli мембранасының екі жағында термиялық теңгерімсіздікті тудырады, бұл плазмидтерді ішке сүзетін сызбаны жасайды деп саналады. ұяшық.
Жалпы, үлкенірек ДНҚ төмен трансформация тиімділігін береді (сондықтан студенттер Lambda кітапханасында pGT� клонын сирек табады...).
Әдетте, ДНҚ-ны нақты қабылдаған жасушаларды іріктеу оларды селективті антибиотикі бар агар пластиналарында өсіру арқылы жүзеге асырылады.

Қарапайым клондау зертханасында, E.coli Трансформация әдетте келесі қол жетімді шешімдермен жүзеге асырылады:

  • құзыретті E.coli жасушалар, жаңадан жасалған немесе -80° қордан
  • байлау реакциясының қоспасы
  • ДНҚ дайджесті (байланыс реакциясында қолданылатындай)
  • бақылау плазмидасының сұйылтылған ерітіндісі

Құрылатын плазмида арқылы түзіледі in vitro ДНҚ фрагменттерін байлау (плазмидтік вектор фрагменттері және донор фрагменттері)

түрлендіру E.coli жасушалар химиялық өңделген E.coli жасушаларының тығыз суспензиясының шағын көлемімен (төмен температурада) плазмидтік ДНҚ-ны (немесе байлау кезінде пайда болған плазмидаларды) араластыру арқылы жүзеге асырылады. 42°C температурада 90 секундтық жылу соққысы ДНҚ молекулаларының бір бөлігін бактерия жасушаларына әкеледі. 37°C температурада бір сағат қалпына келгеннен кейін бактериялар әдетте плазмид төзімділік беретін антибиотикті қамтитын агар пластинасына таралады. Трансформаторлар (бұзылған плазмида молекуласын сәтті қабылдаған бактериялар) осылай таңдалады, өйткені трансформацияланбайтындар антибиотикте өсе алмайды. Көбеюге қабілетті дөңгелек ДНҚ молекулалары ғана бактерияларға антибиотиктерге төзімділік көрсете алады.
Сызықтық ДНҚ бактериялық жасушаның ішінде репликацияланбайды (және экзонуклеаза белсенділігін сақтай алмайды)!

Қарапайым клондау зертханасында, бір клондау тәжірибесі үшін төрт түрлендіру орындалады келесі ДНҚ қоспаларын қолдану:

  1. байлау реакциясының қоспасы
  2. векторлық ДНҚ дайджесті және донорлық ДНҚ дайджесті (байланыс реакциясында қолданылатын екеуінің қоспасы)
  3. 1 нг кесілмеген плазмидті ДНҚ (мысалы, векторлық плазмида)
  4. су (= ДНҚ жоқ)

2, 3 және 4 байлау және түрлендіру протоколының басқару элементтері болып табылады.
Стандартты жылу соққысының трансформациясында 3-тегі бір нг плазмида 100-1000 колония беруі керек.


ЭКСПЕРИМЕНТТЫ

E. coli Бастапқы мәдениеттер:

колониялары E. coli штаммдар (DH5α – Invitrogen, Cat № 12297-016, Xl-1 Blue – Stratagene, Cat № 200247, SCS110 – Stratagene, Cat № 200249, JM109 – Promega, Cat № L2001, Cat No. Introgen Cat. No. -10, BL21-(DE3)-PLysS – Invitrogen, Cat № C6060-03) LB [Luria–Bertani (сорпа)] агарында (Biopolis Shared Facilities, A*STAR) қаптау арқылы коммерциялық көздерден оқшауланған. Жалғыз колониялар түнде 2 мл тиісті орталарға егілді. Шамамен 100 мкл дақылдар 50 мл алдын ала қыздырылған тиісті орталарға егілді [OD ерте лог фазасына дейін өсуге мүмкіндік береді.600 (оптикалық тығыздық) көрсеткіші 0,3–0,5) [8,9] (Қосымша кесте S1at http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm), содан кейін бірден мұзға 15 минутқа қою және центрифугалау. Түйіршіктер әдіске тән буферлерде қайта суспензияланды (CaCl2 [4,13], DMSO [12] және Ханахан әдісі [10] немесе қосымша деректер). Барлық бактериялар 37°C температурада 200–220 айн/мин қарқынды шайқау арқылы өсірілді (Certomat BS-1, Satorius Stedim Biotech). Барлық центрифугалау қадамдары 3200 градуста орындалды g Eppendorf, 5804R үлгісін 4°C температурада пайдалану.

Алты әдіс бойынша төрт әдісті салыстыру E. coli штаммдар

Салыстыру үшін келесі параметрлер стандартталған: (1) Трансформация және TrE есептеу үшін 100 мкл бактерия аликвотын пайдалану (2) Тек PUC18 плазмидін пайдалану (3) Өсу және жылу соққысынан кейінгі өсу үшін LB ортасын пайдалану (4) Пайдалану трансформация үшін 45 с жылу соққысы және (5) бастапқы 50 мл бактерия дақылдарынан 4 мл соңғы қайта суспензия көлемі.

MgCl2–CaCl2 әдіс: Сэмбрук пен Рассел әдісінен бейімделген [13]

50 мл культуралардан түйіршіктелген бактериялар 15 мл 0,1 М MgCl ішіндегі жұмсақ тамшуырмен қайта суспензияланды.2 (ионсыздандырылған суда дайындалған және автоклавта жасалған) (BDH, VWR International) және мұзда 10 минут бойы инкубацияланған. Бактериялар 10 минут ішінде 4 ° C температурада 4 к айн / мин жылдамдықта түйіршіктелген, 15 мл 0,1 М CaCl ішінде қайта суспензияланған.2, және мұзда 30 минут бойы инкубациялады. Айналдырудан кейін үстіңгі зат тасталды және түйіршіктер 0,1 М CaCl 4 мл (стандартталған көлем) ішінде ақырын қайта суспензияланды.2 20% (көлем/көлем) глицерин ерітіндісімен және -80°C температурада 100 мкл аликвотта сақталады.

CaCl2 әдіс: Мандель мен Хига әдісінен бейімделген және өзгертілген [4]

50 мл культурадан алынған түйіршіктелген бактерия штаммдары 25 мл (бастапқы культураның жарты көлемі) мұздай салқын 0,1 М CaCl ішіндегі жұмсақ тамшуырмен қайта суспензияланды.2 (BDH) (деиондалған суда дайындалған және автоклавта) және мұзда 1 сағат бойы инкубацияланған. Бактерия суспензиялары 10 минут ішінде 4 ° C температурада 4 к айн / мин жылдамдықта түйіршіктелген, содан кейін 4 мл 0,1 М CaCl ішіндегі жұмсақ суспензиямен өңделген.2+15% (көлем/көлем) глицерин және -80°C температурада 100 мкл аликвотта сақталады.

DMSO әдісі: Чунг пен Миллердің әдісінен бейімделген және өзгертілген [12]

50 мл мәдениеттерден алынған түйіршіктелген бактерия штаммдары 4 мл мұз салқын TSB (трансформация сақтау буфері: рН 6,1 кезінде LB сорпасы, 10% (салм/көлем) PEG4450, 5% (көлем/көлем) DMSO, 10 мМ MgCl) қайта суспензияланды.2 және 10 мМ MgSO4, сүзгі 0,45 мкм сүзгімен зарарсыздандырылған) және мұзда 30 минут бойы инкубацияланған. Содан кейін бактериялар 100 мкл аликвотта -80°C температурада сақталды.

Ханахан әдісі: Ханханнан бейімделген және өзгертілген [10]

Толық түпнұсқа хаттамалар және FSB (мұздатылған сақтау буфері) дайындығы http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm сайтындағы Қосымша деректерде берілген.

50 мл культурадан алынған түйіршіктелген бактерия штаммдары 16,5 мл FSB (10 мМ CH) ішінде ақырын қайта суспензияланды.3CO2K рН 7,5, 45 мМ MnCl2, 10 мМ CaCl2, 0,1 М KCl, 3 мМ [Co(NH3)6]Cl3, 10% глицерин) және мұзда 15 мин инкубациялады. Содан кейін бактериялар 10 минут ішінде 4 ° C температурада 4 к айн / мин жылдамдықта түйіршіктелген және 4 мл FSB ішінде қайта суспензияланған. 140 мкл DMSO 5 минут аралықпен суспензияның ортасына ақырын айналдыру арқылы екі рет қосылды. Бактерия суспензиялары 200 мкл аликвотта -80°C температурада сақталды.

Стандартталған әдістер үшін трансформация хаттамасы

45 s heat-shock transformation – (modified from Stratagene's recommended protocol) – used for all methods except the DMSO method

100 μl of competent bacteria were mixed with 1 μl of control pUC18 plasmid [0.1 ng/μl in nuclease-free water (Agilent, 200231-42)] in cold 14 ml round bottomed tubes (BD, Product no. 352059) and incubated on ice for 30 min. A 42°C heat-shock of 45 s was performed, followed by immediate placement on ice for 2 min. 100 μl of LB media were added to the bacterial suspensions before incubations at 37°C for 1 h. The entire aliquot was plated out on 1.5% (w/v) LB agar plates with 100 μg/ml ampicillin (Goldbio, A-301-5) at 37°C overnight.

Transformation of competent bacterial (DMSO method):

100 μl of thawed DMSO competent cells were transferred to ice-cold 14 ml round bottomed tubes (BD, Product no. 352059) and incubated with 0.1 ng/ul of control pUC18 plasmid (Agilent, 200231-42) on ice for 30 min. The cell suspensions were then allowed to grow in 0.9 ml of TSB with 20 mM of glucose at 37°C in vigorous shaking (speed 200–220) for 1 h. The cells were then plated on LB agar plates with 100 μg/ml ampicillin and incubated overnight at 37°C.

Comparison of the culture media:

Optimization of culture media used for starter cultures

The various strains of E. coli were induced to be competent using the established best methods as described above, and varying the use of SOB (super optimal broth) [10] or LB [14] as the starting culture media. Heat shock was standardized to 45 s.

Comparison of the heat-shock incubation times for transformation

The incubation times of the heat shock for all the six strains were made using the exact transformation protocol as described by Hanahan [10] (Supplementary data at http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm), with the exception of varying the incubation to either 45 or 90 s in the 42°C heat bath.

Data collection and computation of TrE

All bacterial colonies on the plated agar were counted manually. The TrE were calculated according to the formula provided by Stratagene, and adjusted to aliquot volumes 100 μl.

Fourfold concentration of optimally induced bacteria

The bacterial strains were concentrated prior to freezing and storage by virtue of a four-fold reduction in the volume of the final storage buffer used to resuspend the strains as per their optimized protocols.

Statistical computation and analysis

For comparison of the four methods on the six strains, both ANOVA and independent т tests were used. ANOVA test was performed to determine the reproducibility of the TrE within each method (Supplementary Table S2A at http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm), as well as the differences between the four methods (Supplementary Table S2B at http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm). Тәуелсіз т test was used for the comparison of pair-wise method comparisons (Supplementary Table S2C at http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm), media (Figure 2), heat-shock incubation times (Figure 3), and four-fold concentration and neat (Figure 4). All statistical analysis was performed using SPSS ver. 17 (IBM) at a 95% confidence interval.


Материалдар мен тәсілдер

Материалдар

ішек таяқшасы strains DH5α, Jm107 және BL21 (DE3) were obtained from Life Technologies, Fermentas and Novagen, respectively. pGEM–T, pET-28a және pCAMBIA 3300 plasmids were purchased from Promega (#A3600), Novagen (#69864-3) and Cambia Labs, respectively. Luria–Bertani (LB) broth and LB agar were both from Sigma-Aldrich Co. (#L3022 and #L2897). Autoclaved CMC solution was made of 80 mM CaCl2(2H2O) (Sigma-Aldrich, #C2536) and 20 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich, #M8266). Glycerol (should be autoclaved), ampicillin (Ap) and kanamycin (Km) were all obtained from Sigma-Aldrich (corresponding to #G5516, #A9393 and #K1377 catalogue numbers).

Transformation protocol

Single colonies of E. coli strains included in this study were separately inoculated in 10 mL of LB broth medium and were left overnight at 37 °C with moderate shaking (250 r.p.m.). A falcon tube containing culture medium (without bacteria) was considered as control. The aforementioned cultures in a volume of 200 μL were transferred into 10 mL of LB broth containing 2.5% glycerol inside 50-mL falcon tubes and incubated at 37 °C for 3 h with moderate shaking (250 r.p.m.). OD of the cultures was regularly monitored. The culture tubes were incubated on ice when the OD600 nm became 0.9 ( Tang т.б., 1994). The bacterial cultures were transferred into 2-mL microtubes and centrifuged at 1600 g for 5 min at 4 °C. The supernatant was discarded, and the tubes were stood in an inverted position on a sterile Whatman paper to remove the last drops of media. Pellets were gently resuspended in 250 μL ice-cold CMC solution and stored on ice for 30 min. The cells were recovered by centrifugation at 1000 g for 3 min at 4 °C. The supernatant was discarded, then 250 μL of CMC/glycerol mixture (70 : 30 ratio) was added, and pellets were gently resuspended. 1 × 10 9 copy numbers of pCAMBIA3300, pET-28a және pGEM-T plasmids in uncut form were added in a volume not exceeding 5% of that of the competent cells ( Hanahan, 1983). Nanogram weights for pCAMBIA3300, pET-28a және pGEM-T vectors to include 1 × 10 9 copies were 9.1, 5.8 and 3.25, respectively. Contents of tubes were gently mixed and incubated on ice for 30 min. Ice-cold LB broth (20 μL) was added to tubes while they were being kept on ice (In this protocol, SOC medium could be used instead of LB). Tubes were immediately vibrated at 37 °C using a Heidolph Reax Top test tube vibrating shaker for 10 min. 500 μL of prewarmed 37 °C LB broth was added to each tube. Tubes were incubated at 37 °C shaking incubator for 30 min with moderate shaking at 250 r.p.m. Cells were collected by centrifugation at 1600 g for 3 min at room temperature. The liquid phase was discarded under aseptic conditions, and 50 μL of 37 °C LB broth was added into each tube then, the bacterial pellets were resuspended completely (Km resistance was considered as selectable marker for pET-28a and pCAMBIA. Am resistance was used for screening of bacteria transformed with pGEM-T vector). Final concentrations of Am and Km in the reaction tubes were adjusted to 50 and 30 μg mL −1 , respectively. Contents of these tubes were transferred on screening plates containing appropriate antibiotics. Each mixture was spread on a single plate with a sterilized bent glass rod. The plates were incubated at 37 °C for 12–16 h in an inverted position, and subsequently, plates were collected to count the colonies. All experiments were carried out in triplicate.

Technical hints

The current protocol should be carried out under aseptic condition. Furthermore, during the transformation process, starvation of bacteria has a negative impact on their viability. It should also be noted that if the competent cells are not being used immediately, they should be stored in −70 °C until needed. An important consideration in preparation of competent cells is choosing a suitable OD to harvest the bacteria. The OD600 nm must be < 0.9–1. The highest transformation efficiencies have been obtained at two separate points in the growth curve of E. coli: I in early-to-mid-log phase (OD600 nm = 0.4) ( Hanahan, 1983) and II in late-log phase (OD600 nm = 0.95) ( Tang т.б., 1994). The optimum concentration of glycerol used in media was 2.5%. In this concentration, transformation efficiency and OD were both acceptable (data not shown).

Статистикалық талдау

In order to compare vibration and glycerol-mediated method with the common heat-shock procedure ( Cohen т.б., 1972), vibration and heat-shock methods were both applied in media with and without glycerol and the four different processes were compared. Data were analysed using spss 14 according to completely randomized design. Analysis of variance was performed within each plasmid. Means were compared by the Duncan test at alpha value of (П < 0,05).


Transformation efficiency should be determined under conditions of cell excess. [1] The number of viable cells in a preparation for a transformation reaction may range from 2×10 8 to 10 11 most common methods of E. coli preparation yield around 10 10 viable cells per reaction. The standard plasmids used for determination of transformation efficiency in ішек таяқшасы are pBR322 or other similarly-sized or smaller vectors, such as the pUC series of vectors. Different vectors however may be used to determine their transformation efficiency. 10–100 pg of DNA may be used for transformation, more DNA may be necessary for low-efficiency transformation (generally saturation level is reached at over 10 ng). [2]

After transformation, 1% and 10% of the cells are plated separately, the cells may be diluted in media as necessary for ease of plating. Further dilution may be used for high efficiency transformation.

Transformation efficiency can be measured in transformants or colony forming unit (cfu) per μg DNA used. A transformation efficiency of 1×10 8 cfu/μg for a small plasmid like pUC19 is roughly equivalent to 1 in 2000 molecules of the plasmid used being transformed. жылы E. coli, the theoretical limit of transformation efficiency for most commonly used plasmids would be over 1×10 11 cfu/μg. In practice the best achievable result may be around 2–4×10 10 cfu/μg for a small plasmid like pUC19, and considerably lower for large plasmids.

Individual cells are capable of taking up many DNA molecules, but the presence of multiple plasmids does not significantly affect the occurrence of successful transformation events. [3] A number of factors may affect the transformation efficiency: [1]

Plasmid size – A study done in E. coli found that transformation efficiency declines linearly with increasing plasmid size, i.e. larger plasmids transform less well than smaller plasmids. [3]

Forms of DNA – Supercoiled plasmid have a slightly better transformation efficiency than relaxed plasmids – relaxed plasmids are transformed at around 75% efficiency of supercoiled ones. [3] Linear and single-stranded DNA however have much lower transformation efficiency. Single-stranded DNAs are transformed at 10 4 lower efficiency than double-stranded ones.

Genotype of cells – Cloning strains may contain mutations that improve the transformation efficiency of the cells. Мысалға, E. coli K12 strains with the deoR mutation, originally found to confer an ability of cell to grow in minimum media using inosine as the sole carbon source, have 4-5 times the transformation efficiency of similar strains without. For linear DNA, which is poorly transformed in E. coli, the recBC немесе recD mutation can significantly improve the efficiency of its transformation.

Growth of cellsE. coli cells are more susceptible to be made competent when it is growing rapidly, cells are therefore normally harvested in the early log phase of cell growth when preparing competent cells. The optimal optical density for harvesting cells normally lies around 0.4, although it may vary with different cell strains. A higher value of 0.94-0.95 has also been found to produce good yield of competent cells, but this can be impractical when cell growth is rapid. [4]

Methods of transformation – The method of preparation of competent cells, the length of time of heat shock, temperature of heat shock, incubation time after heat shock, growth medium used, and various additives, all can affect the transformation efficiency of the cells. The presence of contaminants as well as ligase in a ligation mixture can reduce the transformation efficiency in electroporation, [5] and inactivation of ligase or chloroform extraction of DNA may be necessary for electroporation, alternatively only use a tenth of the ligation mixture to reduce the amount of contaminants. Normal preparation of competent cells can yield transformation efficiency ranging from 10 6 to 10 8 cfu/μg DNA. Protocols for chemical method however exist for making supercompetent cells that may yield a transformation efficiency of over 1 x 10 9 . [6] Electroporation method in general has better transformation efficiency than chemical methods with over 1 x 10 10 cfu/μg DNA possible, and it allows large plasmids of 200 kb in size to be transformed.

Damage to DNA – Exposure of DNA to UV radiation in standard preparative agarose gel electrophoresis procedure for as little as 45 seconds can damage the DNA, and this can significantly reduce the transformation efficiency. [7] Adding cytidine or guanosine to the electrophoresis buffer at 1 mM concentration however may protect the DNA from damage. A higher-wavelength UV radiation (365 nm) which cause less damage to DNA should be used if it is necessary work for work on the DNA on a UV transilluminator for an extended period of time. This longer wavelength UV produces weaker fluorescence with the ethidium bromide intercalated into the DNA, therefore if it is necessary to capture images of the DNA bands, a shorter wavelength (302 or 312 nm) UV radiations may be used. Such exposure however should be limited to a very short time if the DNA is to be recovered later for ligation and transformation.



Пікірлер:

  1. Sedgewic

    I've already seen it somewhere

  2. Kazilkis

    Today, I signed up specifically to join the discussion.

  3. Mekhi

    Now everything became clear to me, thank you for your help in this matter.

  4. Tzadok

    You are right, not a good time

  5. Shanahan

    Теңдессіз))))))

  6. Rollan

    Бұл өте құнды пікір

  7. Goltizil

    сүйкімді хабарлама



Хабарлама жазыңыз